粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果研究

黃駒輝，黃其春，楊彩麗，檀新珠，何 茜，趙成成

(1.龍巖學院 生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.福建農林大學 動物科學學院，福建 福州 350002)

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粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果研究

黃駒輝1,2，黃其春1*，楊彩麗1，檀新珠1，何 茜1，趙成成1

(1.龍巖學院 生命科學學院，福建 龍巖 364012；2.福建農林大學 動物科學學院，福建 福州 350002)

目的：研究粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的抑菌效果。方法：以80%乙醇為浸提溶劑，研究粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果。結果：粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的最佳提取條件為料液比1∶10，提取時間為1.5h，提取溫度為70℃，在此條件下進行抑菌試驗，粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，其抑菌圈直徑分別為15.50mm、15.82mm和16.48mm，最低抑菌濃度分別為100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。結論：粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌效果。

粗葉懸鉤子葉子；提取物；抑菌效果

粗葉懸鉤子(RubusaleaefoliusPoir.)為薔薇科(Rosaceae)樹莓屬(RubusL.)植物，又名懸鉤子屬植物，分布廣泛，具有較高的營養和藥物價值[1-2]。在民間，粗葉懸鉤子的根、葉均可入藥，具有活血化瘀、祛風祛濕、清熱解毒、止血止痛、固腎澀精等功效。現代醫學研究發現，懸鉤子屬植物具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、保肝、鎮痛等多種作用[2-3]。目前，有關粗葉懸鉤子的藥理活性研究僅有零星報道，主要集中在抗肝損傷方面[4]，而有關粗葉懸鉤子的抗菌作用研究還未見報道。為此，本實驗擬以80%乙醇為浸提溶劑，研究粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的抑菌效果，旨在為粗葉懸鉤子的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 粗葉懸鉤子葉子 采自福建省永定縣，曬干備用。

1.1.2 供試菌株 大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella sp)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aurreus)，由龍巖學院生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.3 培養基 大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌采用牛肉膏蛋白胨培養基。

1.1.4 主要儀器設備 FW80高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)、2XZ-2型旋片式真空泵(臨海市譚氏真空設備有限公司)、D2F-6020真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)、LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)、SW-CJ-1FD型單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、SHP-150生化培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)、DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物提取條件研究 粗葉懸鉤子葉子經粉碎后過篩，取一定質量粉末，以80%乙醇為浸提溶劑，在前期單因素試驗的基礎上，選取料液比、提取時間、提取溫度三個因素的最優試驗范圍，以提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小作為指標，通過正交試驗確定最佳提取條件。提取液經過濾除渣、棄濾液沉淀物后，置于真空度為0.09MPa(60℃)的真空干燥箱中濃縮，制得粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物浸膏，4℃保藏備用。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.2.2 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果測定 采用紙片法[5]，取直徑7mm滅菌濾紙片，放入由最佳提取條件制得的粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的浸膏中浸泡12h備用。挑取各供試菌種進行斜面活化后，挑取部分菌落于無菌生理鹽水中，制成菌懸液(菌體溶度約為104～105CFU/mL)。取各供試菌懸液0.2mL，涂布于相應的平板中，放置15min后，將已風干的濾紙片貼在平板上，每個平板貼3片，并以生理鹽水為對照，每種供試菌重復3次。各供試菌在培養一段時間后，測定濾紙片抑菌圈直徑大小(mm)，并參考NCCLS推薦的標準進行判斷[6]。以抑菌圈直徑>20mm為極敏；抑菌圈直徑在15～20mm之間為高敏；抑菌圈直徑在10～14mm之間為中敏；抑菌圈直徑<10mm為低敏；無抑菌圈為耐藥。

1.2.3 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物最低抑菌濃度測定 采用瓊脂稀釋法[7]，制備粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物終濃度分別為200、100、50、25、12.5g/mL的平板。取各供試菌懸液100μL，涂布于相應的平板中，放置15min后，培養、觀察其生長情況。每個濃度重復3次。另取同一濃度系列，不接種任何菌作為空白對照，以無菌落生長的最低濃度為最低抑菌濃度[8]。

2 結果與分析

2.1 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物提取條件

正交試驗結果見表2，正交試驗結果方差分析見表3。由表2和表3可知，A(料液比)、B(提取時間)、C(提取溫度)三個因素對粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果的影響順序從主到次依次為A(料液比)>B(提取時間)>提取溫度(C)。由表2中的極差數據R可見，A1值在A內較大，B1值在B內較大，C2值在C內較大，理論上最優水平為A1B1C2。由于A1B1C2不存在于正交試驗組合中，需要補做試驗，通過3次重復試驗測得抑菌圈直徑為16.48mm，此結果與正交試驗中的A1B2C2(16.26mm)的結果非常接近，因此將粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的最佳提取條件確定為A1B2C2，即料液比為1︰10(g/mL)、提取時間為1.5h、提取溫度為70℃，此時粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為16.26mm。

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗結果方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00。

2.2 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物抑菌效果

粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對供試菌的抑菌效果見表4。由表4可知，該提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，其次是沙門氏菌、大腸桿菌，抑菌圈分別為16.48mm、15.82mm、15.50mm。

表4 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對供試菌的抑菌效果和最低抑菌濃度

2.3 粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物最低抑菌濃度

粗葉懸鉤子乙醇提取物對供試菌的最低抑菌濃度見表4。由表4可知，該提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。

3 討論

粗葉懸鉤子具有較高的營養和藥用價值，在我國傳統中醫藥中應用廣泛。目前，有關粗葉懸鉤子的藥理活性研究僅有零星報道，主要集中在抗肝損傷方面[4]，而有關粗葉懸鉤子的抗菌作用研究還未見報道。現代藥理學研究表明，粗葉懸鉤子葉子的化學成分復雜，其活性成分主要包括三萜、黃酮、鞣質、甾醇等化合物[4]，而且這些化合物具有抗菌、殺菌作用[9]。本試驗以80%乙醇為浸提溶劑，研究了粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結果發現，以提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小作為指標，粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物的最佳提取條件為料液比1∶10、提取時間1.5h、提取溫度70℃。在此條件下進行抑菌試驗，粗葉懸鉤子葉子乙醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，其抑菌圈直徑分別為15.50mm、15.82mm和16.48mm，最低抑菌濃度分別為100mg/mL、50mg/mL和50mg/mL。因試驗選用的菌種較少，有關粗葉懸鉤子的抗菌作用還有待于深入研究。

[1] 孫長清,邵小明,王黎明,等.懸鉤子屬植物的開發利用概述[J].廣西植物,2004,24(6):578-582.

[2] 韓 加,劉繼文.懸鉤子屬植物生物學作用研究進展[J].中國野生植物資源,2009,28(2):1-4,49.

[3] 孟祥娟,劉斌,熱增才旦,等.懸鉤子屬植物化學成分及藥理活性研究進展[J].天然產物研究與開發,2011,23(4):767-775,778.

[4] 陳旺,吳志生,章靚,等.粗葉懸鉤子化學成分及藥理作用研究進展[J].亞太傳統醫藥,2009,5(7):141-143.

[5] 張均田.現代藥理實驗方法[M].北京:北京醫科大學協和醫科大學聯合出版社,1998:1409-1415.

[6] 倪語星,王金良,徐英春,等.抗微生物藥物敏感性試驗規范[M].第2版.上海:上海科學技術出版社,2009:41-49.

[7] 沈關心.微生物與免疫學[M].北京:人民衛生出版社,2003:310.

[8] 李焰,楊小燕,林躍鑫,等.銀杏葉有效成分提取與抑菌效果研究[J].中國畜牧雜志,2006,42(15):54-56.

[9] 李葉,唐浩國,劉建學.黃酮類化合物抑菌作用的研究進展[J].家產品加工:學刊,2008(12):53-54,69.

(責任編輯：尹晨茹)

2015-01-16

2013年度龍巖學院大學生創新創業訓練計劃項目

黃駒輝(1990-)，男，龍巖學院碩士研究生，研究方向為預防醫學。

黃其春(1969-)，男，博士，龍巖學院教授，研究方向為營養和免疫。

R285

A

1673-2197(2015)10-0036-02

10.11954/ytctyy.201510015