星點設(shè)計-效應面法優(yōu)選五倍子水提工藝研究

羅 悅 ，李建利,2，陳梓賢，王利潔

(1.成都中醫(yī)藥大學 藥學院，四川 成都 611137； 2.四川省中醫(yī)藥科學院 中醫(yī)研究所，四川 成都 610031)

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星點設(shè)計-效應面法優(yōu)選五倍子水提工藝研究

羅 悅1，李建利1,2，陳梓賢1，王利潔1

(1.成都中醫(yī)藥大學 藥學院，四川 成都 611137； 2.四川省中醫(yī)藥科學院 中醫(yī)研究所，四川 成都 610031)

目的：優(yōu)選香蘞痔瘡栓中五倍子的水提工藝條件。方法：采用高效液相色譜法測定沒食子酸含量并進行方法學考察；以沒食子酸含量及干浸膏收率為綜合評價指標，選取影響水溶性成分提取率的蒸餾水用量、煎煮時間作為考察因素，應用星點設(shè)計-效應面法優(yōu)選最佳水提工藝條件。結(jié)果：星點設(shè)計得出的最佳提取工藝為提取時間70min，溶劑劑量為7.5倍量的水。結(jié)論：所選方法能較好地優(yōu)選香蘞痔瘡栓中五倍子的水提工藝，所建立的二項式模型預測值良好。

沒食子酸；提取工藝；星點設(shè)計-效應面法

香蘞痔瘡栓為四川省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)研究所針對痔瘡所研制的新藥，由五倍子等多味中藥組成。五倍子始載于《開寶本草》，性酸、澀、寒，歸肺、大腸、腎經(jīng)，具有斂肺降火、澀腸止瀉、固精縮尿、止汗、止血、解毒、斂瘡等多種功效。現(xiàn)代藥理學研究表明五倍子具有抗菌、抗病毒、清除自由基、抗氧化收斂等作用[1-3]。五倍子的主要成分為沒食子酸，因此選擇水溶性成分沒食子酸作為有效成分的參考指標之一。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AT型高效液相色譜儀(儀器包括：LC-20AT色譜工作站、SD-20AT紫外檢查器，日本島津公司)；電熱套；FA1104N型電子天平；KQ5200型超聲清洗器；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋DHG-91；40A型電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 試藥

五倍子飲片(四川省中藥飲片有限責任公司，產(chǎn)地：四川，批號130723)；沒食子酸供含量測定的對照品(購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110831-200802)。甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 沒食子酸含量測定

2.1.1 色譜條件 參照《中國藥典》2010年版一部中“五倍子”項下沒食子酸含量測定方法[4]進行含量測定試驗。色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0(4.6×250mm，5μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(15∶85)；流速：1mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測波長：275nm。

2.1.2 對照品溶液制備及標準曲線繪制 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置棕色瓶中，加50%甲醇制成濃度分別為0.080 4、0.160 8、0.241 2、0.321 6、0.402 0、0.804 0mg·mL-1的溶液作為對照品溶液備用。取上述對照品溶液各10μL，分別進樣并測定其峰面積。以對照品不同濃度X(mg·mL-1)為橫坐標，峰面積值Y為縱坐標，然后繪制標準曲線，結(jié)果回歸方程為：Y=953 648X-6 386.8，r=0.999。表明沒食子酸濃度在0.080 4～0.804 0mg·mL-1范圍內(nèi)，與峰面積有較好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗 精密量取“2.1”項下對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，沒食子酸峰面積的RSD為1.54%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.1.4 供試品溶液制備 量取“2.2”項下星點試驗樣品溶液5mL，用50%甲醇定容至25mL容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.5 重復性試驗 取“2.2.1”項下星點試驗11號樣品貯備液，按“2.1.4”項下方法平行制備6份供試品溶液，各進樣10μL測定，結(jié)果RSD為1.76%，其中n=6，該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗 精密吸取“2.2.1”項下星點試驗11號樣品貯備液適量，按《中國藥典》2010年版一部附錄 XVIIIA項下方法，測定沒食子酸的加樣回收率。最終得到?jīng)]食子酸平均回收率99.79%，RSD為1.78%(n=6)。

2.2 水提工藝研究

2.2.1 星點實驗設(shè)計及結(jié)果 在查閱文獻及參考預實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上[5-7]，選取溶劑用量、提取時間為考察因素，提取次數(shù)確定為3次。每因素設(shè)5 水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示(2因素星點設(shè)計的α=1.414) 。因素水平見表1，試驗安排和結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 實驗安排與結(jié)果

2.2.2 數(shù)據(jù)分析 實驗結(jié)果按照實驗編號進行，每次提取3次，合并3次濾液。試驗結(jié)果采用以下方法評價：OD=0.3×OD(浸膏得率)+0.7×OD(沒食子酸)。浸膏得率和沒食子酸含量采用 Hansan 方法分別轉(zhuǎn)化為 0 ～1 的“歸一值”，9～13號為重復實驗各指標結(jié)果的均值，浸膏得率和沒食子酸含量越大越好，計算歸一值。

采用Designexpert8.0.6軟件，將總體評分分別對因素AB進行多元線性回歸以及二項式擬合，多元線性回歸模型不具有顯著性，得到二項式擬合方程為OD=0.93+0.13× X2-0.095× X1-0.16×X2 × X1-0.33× X22-0.29 ×X12。P值模型為0.003，X1為0.0498，X2為0.0156，X1X2為0.0249，X12為0.0003，X22為0.000 1，均小于0.05，具有顯著性，且擬合度也較好，預測性良好。所得的影響平面圖和立體圖見圖1和圖2。由效應面圖得出最佳工藝為溶劑劑量為7.54，提取時間為67.59。根據(jù)實際情況定位7.5倍量的水，提取時間為70min。

圖1 總評分平面圖

2.2.3 驗證試驗 根據(jù)“2.2.2”項下確定的工藝條

件平行進行3次試驗，結(jié)果如表3。總評分實際平均值與預測值相比，偏差為-6.24%，說明建立的模型良好，所選取的工藝重現(xiàn)性良好。

3 討論

本研究選用的星點效應面法(central composite design，CCD)是國外目前常用的一種先進的實驗設(shè)計方法，運用二項式擬合，并根據(jù)星點設(shè)計所建立的數(shù)學模型描繪效應面，國內(nèi)目前對于星點設(shè)計-效應面法在五倍子的研究上比較少，通過星點設(shè)計-效應面法可直觀方便地確定較優(yōu)的制備工藝。該法具有精密度高、試驗次數(shù)少、預測性良好的優(yōu)點。

星點設(shè)計效應面法針對非連續(xù)性數(shù)據(jù)不能夠進行很好的處理，本實驗中考察的提取時間和溶劑劑量都是連續(xù)性影響因子，而提取次數(shù)是非連續(xù)性影響因子，參考文獻將其定為3[8]。此次試驗所得到的工藝方便可行，能夠用于大生產(chǎn)，為香蘞痔瘡栓的研究奠定了基礎(chǔ)。

表3 驗證試驗結(jié)果

[1] 樸春梅.五倍子的研究近況[J].中國民間療法,2005,13(2):63-65.

[2] 李紅然,付大友.五倍子中有效成分提取方法研究進展[J].廣東化工,2010,37(10):71,79.

[3] 周勁光.五倍子的藥理作用與臨床研究進展[J].海峽藥學,2010,22(4):30-32.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:62.

[5] 陳笳鴻,畢良武.塔拉粉直接堿水解制備沒食子酸的工藝研究及應用[J].林產(chǎn)化學與工業(yè),1995,15(1):1-8.

[6] 楊躍輝,姜清華,林智娟.HPLC法測定五倍子油膏中沒食子酸的含量[J].化學與生物工程,2010,27(6):90-91.

(責任編輯：尹晨茹)

2015-01-07

四川省科技廳支持項目(2014-2-12)

羅悅(1990-)，女，成都中醫(yī)藥大學碩士研究生，研究方向為藥劑學。

李建利(1957-)，男，四川省中醫(yī)藥科學院主任藥師，成都中醫(yī)藥大學碩士生導師，研究方向為中藥新制劑、新劑型與新技術(shù)。

R284.2

A

1673-2197(2015)10-0031-02

10.11954/ytctyy.201510013