不同粉體三、四妙丸HPLC指紋圖譜對比研究

肖 娟，蔡 萍，萬 丹，張水寒

(湖南省中醫(yī)藥研究院 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410006)

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不同粉體三、四妙丸HPLC指紋圖譜對比研究

肖 娟，蔡 萍，萬 丹，張水寒*

(湖南省中醫(yī)藥研究院 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410006)

目的：分別建立超微粉和細(xì)粉三妙丸和四妙丸的HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行對比研究。方法：用HPLC色譜法，對不同粉體形態(tài)的妙丸建立指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件”建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，對不同粉體形態(tài)各妙丸的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。結(jié)果：方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。兩種不同粉體形態(tài)的妙丸指紋圖譜的相似度均大于0.90，兩者在共有峰上沒明顯差別，而峰面積有差別。結(jié)論：該方法穩(wěn)定準(zhǔn)確，建立的HPLC指紋圖譜，能從整體上反映出三妙丸和四妙丸的化學(xué)成分信息，為建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考依據(jù)。

妙丸；HPLC 指紋圖譜；超微粉

二妙丸、三妙丸和四妙丸均是收載于2010版《中國藥典》的經(jīng)典名方，廣泛用于治療濕熱痰痹引起的各種濕熱浸淫疾患[1-3]。三妙丸、四妙丸都是從二妙丸演變而來，三妙丸中多了一味化瘀通絡(luò)、補(bǔ)肝強(qiáng)腎、引藥下行的牛膝；四妙丸中薏苡仁能利濕舒筋，故主治下焦?jié)駸嶂宰C、痿證[4-5]。與傳統(tǒng)粉碎技術(shù)相比，超微粉碎技術(shù)可將中藥材粉碎成微米級(jí)甚至納米級(jí)，顯著提高了藥材細(xì)胞壁的破碎率，粒徑大小分布更均勻，表面積增加，利于有效成分的溶出、釋放與吸收，提高生物利用度[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]超微粉妙丸功效明顯優(yōu)于細(xì)粉丸。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段, 通過指紋特征相似程度的比較, 可達(dá)到判斷藥材及成藥的真?zhèn)巍?yōu)劣、質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性,也已經(jīng)成功用于中成藥生產(chǎn)過程中[8]。本研究通過建立細(xì)粉和超微粉三妙丸和四妙丸HPLC指紋圖譜，以探索HPLC指紋圖譜能否全面反映出化學(xué)成分信息以及不同粉體間存在的差異，為制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BFM-T6BI“貝利”微粉機(jī)(濟(jì)南貝利粉碎技術(shù)工程有限公司)；Winner3001 干粉激光粒徑儀(濟(jì)南微納儀器有限公司)；柴田式粉碎機(jī)(天津市渤海鑫茂制藥設(shè)備有限公司)；可傾式多功能制丸機(jī)(DZ-20,溫嶺市林大機(jī)械有限公司)； 高效液相色譜儀 (SHIMADZ-LC-20A，日本島津)；色譜柱：Inertsil ODS-2(GL Sciences Inc，250mm×4.6mm,5μm)；T-214電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試劑

甲醇(色譜級(jí))，甲醇(分析純)，醋酸(色譜級(jí)), 怡寶蒸餾水。

鹽酸小檗堿對照品(批號(hào)：110713-200208，中國食品藥品檢定研究院)。

1.3 材料

細(xì)粉和超微粉三妙丸和四妙丸均為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)檢驗(yàn)符合藥典要求。

細(xì)粉妙丸制劑工藝：取處方比例的藥材，混合采用柴田式粉碎機(jī)粉碎，過5號(hào)篩，得細(xì)粉，混勻，在可傾式多功能制丸機(jī)中用水泛丸，70℃干燥，滅菌即得。

超微粉妙丸最佳制劑工藝：取處方比例的藥材混合，采用貝利粉碎機(jī)粉碎，粉碎最佳參數(shù)是藥材干燥至水分7%以下，介質(zhì)填充率60%～70%，振幅為5mm，粉碎溫度1～15℃，粉碎時(shí)間25min,采用Winner3001 干粉激光粒徑儀測得粉體粒徑的D90<90μm(90%粒徑值)，得超微粉混勻，在可傾式多功能制丸機(jī)中用水泛丸，70℃干燥，滅菌即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為: Inertsil ODS-2(GL Sciences Inc，250mm×4.6mm,5μm)

三秒丸：流動(dòng)相為: A為1%的醋酸水溶液，B為1%的醋酸甲醇溶液；梯度洗脫：0～10min： 2%～5% B，10～15min 5%～15% B，15～25min 15%～25% B，25～45min 25%～55% B，45～65min 55%～85% B。

檢測波長:254nm，柱溫: 35℃，流速:1.0mL·min-1，進(jìn)樣量:10μL。

四妙丸：流動(dòng)相為: A為水溶液，B為甲醇；梯度洗脫：0～45min 10%～45% B，45～65min 45%～85% B。

檢測波長:280nm，柱溫: 30℃，流速:1.0mL·min-1，進(jìn)樣量: 10μL。

2.2 對照品溶液制備

取鹽酸小檗堿適量，精密稱定，置于10mL的量瓶中，加甲醇制成濃度為0.1mg·mL-1的對照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過，備用。

2.3 供試品制備

取10批細(xì)粉三妙丸適量，研細(xì)，取粉末6.0g，精密稱定，至于索氏提取器中，精密加入乙醚100mL，35℃水浴回流5h，棄去乙醚液，殘?jiān)鼡]去乙醚加95%乙醇60mL,回流提取1h，過濾；殘?jiān)?0%乙醇60mL，回流提取2次過濾，合并提取液，濃縮至20mL，用60%乙醇定容至25mL，搖勻，作為供試液，進(jìn)樣前用0.45μm微孔濾膜濾過，得細(xì)粉三妙丸供試品。

取10批超微粉三妙丸適量，研細(xì)，取粉末6.0g，精密稱定，得超微粉三妙丸供試品。

取10批細(xì)粉四妙丸適量，研細(xì)，取粉末6.0g，精密稱定，得細(xì)粉四妙丸供試品。

取10批超微粉四妙丸適量，研細(xì)，取粉末6.0g，精密稱定，得超微粉四妙丸供試品。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄指紋圖譜，以參照峰為對照峰計(jì)算主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果RSD<2.0%,相似度均大于0.95，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10μL, 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8h測定,記錄指紋圖譜，以參照峰為對照峰計(jì)算主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果RSD<2.0%,相似度均大于0.93，符合指紋圖譜要求，表明8h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取超微粉三妙丸同一批次樣品5份,按“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液制備條件操作制備供試品溶液,進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜，以參照峰為對照峰計(jì)算主要色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果RSD<2.0%,相似度均大于0.94，符合指紋圖譜要求，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 參照峰的選擇 由于黃柏中鹽酸小檗堿的含量高，且保留時(shí)間恰當(dāng)，也是質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，故選用鹽酸小檗堿作為參照峰。按“2.1”項(xiàng)下三妙丸的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜，見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿對照品液相色譜

2.5.2 指紋圖譜數(shù)據(jù)的采集 分別取不同粉體三妙丸和四妙丸的供試品，按照“2.1”項(xiàng)下的妙丸的色譜條件方法分別得到細(xì)粉和超微粉妙丸的指紋圖譜，均以鹽酸小檗堿為參照峰，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2004 A版)分別對妙丸的共有色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.5.3 共有峰的標(biāo)定 對10批樣品的圖譜分析比較，計(jì)算各妙丸中不同批次供試品色譜圖中共有峰占總面積的百分比，結(jié)果表明共有峰面積占總面積90%以上，符合指紋圖譜的要求。

2.5.4 指紋圖譜共有模式的建立及相似度評價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2004 A版)分別對三妙丸和四妙丸進(jìn)行相似度分析，以三妙丸為例，以鹽酸小檗堿峰為參比峰,以S4為參照圖譜，經(jīng)過多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配，采用中位數(shù)法生成對照圖譜(圖2)，標(biāo)示了細(xì)分和超微粉三妙丸指紋圖譜中15個(gè)共有峰,其中11號(hào)峰為鹽酸小檗堿峰；同理得到四妙丸中共有峰15個(gè)，見圖3、圖4、圖5、圖6。

圖2 三妙丸典型的HPLC指紋圖譜

2.5.5 相似度評價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2004 A版)進(jìn)行相似度分析，不同粉體三妙丸和四妙丸之間HPLC指紋圖譜的相似度均大于0.91，細(xì)粉和超微粉四妙丸之間的相似度大于0.90，符合指紋圖譜要求。

本實(shí)驗(yàn)建立的指紋圖譜可以從整體上反映出三妙丸和四妙丸化學(xué)成分信息，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考；從指紋圖譜的共有峰來看，不同粉體沒有顯著差別，但在共有峰面積上，超微粉妙丸的峰面積要大于細(xì)粉妙丸(見表3、表4，S1/S2>1)，說明藥材經(jīng)超微粉碎后，粉末均勻，粒徑減小但表面積增大，與提取溶媒的接觸面積增加，相同的提取時(shí)間內(nèi)提取效率提高，有效成分溶出量增加，生物利用度提高，在保證藥效的基礎(chǔ)上，可在一定程度上減少給藥劑量，提高效率。

3 討論

各妙丸檢測波長的選擇都是通過HPLC-DAD檢測, 在色譜條件下,繪出三維色譜圖, 選擇色譜峰信息完整,分離度好, 基線平穩(wěn),干擾最少的波長。采用單因素法對各妙丸的提取方法進(jìn)行考察，回流提取效率更高，且乙醚除去蒼術(shù)中的揮發(fā)油使得色譜峰的分離度更好，檢測信號(hào)更平穩(wěn)，確定采用“2.3”項(xiàng)的提取方法。

圖3 10批超微粉三妙丸的HPLC指紋圖譜

圖4 10批細(xì)粉三妙丸的HPLC指紋圖譜

圖5 10批超微粉四妙丸的HPLC指紋圖譜

圖6 10批細(xì)粉四妙丸的HPLC指紋圖譜

峰號(hào)S1S2S1/S2峰號(hào)S1S2S1/S219811659344731．059173886816609091．0524503594597791．02106962646625751．0538243667595531．091190416247869255941．0444704754373081．08125631165316601．0659743668982991．081311872848113481301．0565098434867241．051414359716182271．057240000122895371．051512274819354021．0488426197813031．08

表4 不同批次細(xì)粉、超微四妙丸共有峰峰面積均值及相應(yīng)比值

注：S1是10批超微粉妙丸各共有峰峰面積均值;S2為10批細(xì)粉妙丸各共有峰峰面積均值。

由于薏苡仁和牛膝的紫外吸收特征較弱，在方劑配伍中用量較少，建立的指紋圖譜中兩者的特征峰不明顯。此外，還需要對指紋圖譜中色譜峰進(jìn)行對應(yīng)藥材的歸屬。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:454-646.

[2] 梁汝慶, 鄭桂芝，孔祥亮. 二妙散到四妙丸的用藥規(guī)律初探[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,22(12):2337-2338.

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(責(zé)任編輯：余 婷)

HPLC Fingerprint Study on Ultro-micro and Nomlal powder of San and Si Miao Pill

Xiao Juan, Cai Ping, Wan Dan, Zhang Shuihan*

(Hunan Acadamy of Chinese Medicine Hunan Chinese Medicine Powder and Innovation Drug Province Department Coconstruction and Key Laboratories, Ministry of Education,Changsha 410006,China)

Objective:To establish HPLC fingerprint of Ultro-micro and Nomlal powder of San and Si Miao Pill respectively and compare the fingerprints.Methods:To establish HPLC fingerprint of Ultro-micro and Nomlal powder of Miao Wan. The HPLC chromatograms were analyzed by the the “traditional Chinese medicine fingerprint similarity calculation software”.Results:The results of methodological study met technical requirements of HPLC fingerprint. The similarities of the Ultro-micro and Nomlal Miao Wan exceeded 0.90, The HPLC fingerprints of Ultro-micro and Nomlal Miao Wan had obvious differences in area of common peaks but less differences in number of common peaks.Conclusion:The HPLC fingerprint method was stable and accurate and could show the whole chemical composition information and provide a basis for the establishment of quality standard for Miao pill.

San and Si Miao Pill；HPLC fingerprint；Ultro-micro Powder

2015-07-10

湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)與重大科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2012GK4103)

肖娟(1978-)，女，湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幹苿?/p>

張水寒(1960-)，女，博士，湖南省中醫(yī)藥研究院博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源、制劑及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：zhangshuihan0220@126.com

R284.1

A

1673-2197(2015)23-0027-04

10.11954/ytctyy.201523011