一種增強(qiáng)免疫力中藥制劑的研發(fā)

賈福懷，陶 剛，吳國(guó)卿

(寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012)

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一種增強(qiáng)免疫力中藥制劑的研發(fā)

賈福懷，陶 剛*，吳國(guó)卿

(寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012)

目的：優(yōu)化一種增強(qiáng)免疫力復(fù)方中藥制劑的提取工藝，并對(duì)研制的復(fù)方中藥制劑進(jìn)行穩(wěn)定性、安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)及功能性評(píng)價(jià)。方法：以粗多糖、總皂苷和淫羊藿苷含量為指標(biāo)，以中藥炙黃芪、淫羊藿、人參、熟地黃、茯苓、甘草為原料，應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝，并對(duì)標(biāo)志性成分的穩(wěn)定性、滅菌工藝進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，并依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》對(duì)研制的復(fù)方中藥制劑進(jìn)行安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)及功能評(píng)價(jià)。結(jié)果：最佳提取工藝條件為：初次提取按料液比1∶10煎煮2h，第2次提取按料液比1∶8煎煮1h。口服液中標(biāo)志性成分均有較好的穩(wěn)定性，在24個(gè)月保質(zhì)期中可以保證產(chǎn)品質(zhì)量的要求。滅菌條件的滅菌效果重現(xiàn)性很好，滅菌工藝條件穩(wěn)定可靠。安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)均未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)，功能評(píng)價(jià)為：受試樣品高劑量組ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和小鼠左后足跖部24h與0h厚度測(cè)量值差值均增加，差異均有顯著性。 結(jié)論：建立的提取方法具有提取效率高、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)安全性毒理學(xué)試驗(yàn)證明屬于無(wú)毒性產(chǎn)品，經(jīng)功能學(xué)試驗(yàn)證明具有增強(qiáng)免疫力的保健功能，長(zhǎng)期食用可改善體質(zhì)、增強(qiáng)免疫力。

復(fù)方中藥制劑；增強(qiáng)免疫力；中藥研制；穩(wěn)定性、安全性；毒理學(xué)

現(xiàn)代社會(huì)，很多疾病發(fā)生的深層原因是免疫力低下或免疫力不健全。人體免疫系統(tǒng)完善，則機(jī)體和諧、健康；反之機(jī)體受損，表現(xiàn)為易感染或者易生病狀態(tài)。“正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”，正氣就是指人體的抗病能力，也就是免疫力[1]，正氣不足表現(xiàn)為虛癥，注意保護(hù)免疫系統(tǒng)不受損害至關(guān)重要。

單一的藥物只能控制或者緩解某些癥狀，很難徹底緩解免疫力低下的復(fù)雜身體狀況，復(fù)方可以提高療效，減少毒副作用。人體免疫系統(tǒng)存在著一定的動(dòng)態(tài)平衡，許多中藥對(duì)人體免疫力的調(diào)節(jié)有著先天優(yōu)勢(shì)。本中藥制劑進(jìn)行復(fù)方配伍時(shí)遵循“君臣佐使”這一重要原則，以炙黃芪和淫羊藿為君藥，對(duì)增強(qiáng)免疫力起主要作用；輔以常用中藥人參、茯苓，能夠補(bǔ)氣生血，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，起到協(xié)調(diào)配合君藥的療效；人參和黃芪皆為重要的補(bǔ)氣扶正藥，兩者合用旺氣生血，可增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能[2]；同時(shí)熟地黃溫和滋陰、益精填髓[3]，甘草緩和矯正陽(yáng)性藥物的火烈藥性、解毒滋補(bǔ)。本復(fù)方可以緩和因人體衰老、生活工作壓力過(guò)大等原因產(chǎn)生的免疫力下降等一系列身體狀況，達(dá)到肝腎陰陽(yáng)同補(bǔ)、固本扶元、祛邪調(diào)理的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料 炙黃芪、淫羊藿、人參、熟地黃、茯苓、甘草(安徽濟(jì)人藥業(yè)有限公司)；低聚果糖(量子高科(中國(guó))生物股份有限公司)；山梨酸鉀(羅蓋特精細(xì)化工有限公司)。

1.1.2 設(shè)備 Agilent 1260高效液相色譜，數(shù)顯恒溫水浴鍋，梅特勒-托利多pH計(jì)，電子分析天平，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，阿貝折射儀，超聲波清洗器，低速離心機(jī)，水浴檢漏滅菌柜，高速管式離心機(jī)，自動(dòng)鎖口機(jī)，鼓風(fēng)干燥箱，恒溫恒濕箱，提取濃縮罐。

1.2 測(cè)定方法

感官：感官鑒定法；可溶性固形物：GB/T 12143；pH：《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)一部附錄Ⅶ G；重金屬、農(nóng)藥殘留：GB 5009；粗多糖：硫酸苯酚法；總皂苷：《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)規(guī)定方法；淫羊藿苷：GB/T 22247；微生物指標(biāo)：GB 4789；安全性毒理學(xué)試驗(yàn)、功能性實(shí)驗(yàn)：衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[6]。

1.3 工藝流程

中藥→切片→一次煎煮→過(guò)濾→二次煎煮→過(guò)濾→合并濾液→離心→濃縮→復(fù)配(低聚果糖、山梨酸鉀、純化水)→煮沸滅菌→冷卻→灌裝→鎖口→熱壓滅菌→冷卻→貼標(biāo)→裝盒→裝箱。

1.4 制劑工藝要點(diǎn)

1.4.1 提取 中藥炙黃芪、淫羊藿、人參、熟地黃、茯苓、甘草以3∶2∶1∶1∶1∶0.5的比例準(zhǔn)確稱量并作相應(yīng)的切片處理，混合均勻后投入中藥提取設(shè)備中加入總藥重10倍量的純化水，夾套中通入蒸汽加熱，煎煮2h，過(guò)濾，得到第1次濾液和濾渣，濾渣繼續(xù)加入總藥重8倍量的純化水煎煮1h，過(guò)濾，得到第2次濾液。

1.4.2 離心、濃縮 將2次濾液合并，經(jīng)過(guò)高速管式離心機(jī)離心處理(15 000r/min，蠕動(dòng)泵上料)去除沉淀，使用中藥濃縮設(shè)備減壓濃縮至相對(duì)密度1.12～1.14(真空度-0.08MPa)。

1.4.3 配料、灌裝 濃縮液轉(zhuǎn)移入配料罐中，加入占濃縮液總重量50%的低聚果糖糖漿、0.4%的山梨酸鉀(用少量純化水溶解)，250%的純化水，配制成口服液，將該口服液煮沸20min，循環(huán)水冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至灌裝設(shè)備，使用鈉鈣玻璃瓶灌裝至規(guī)定的裝量，用鋁制防盜蓋自動(dòng)鎖口機(jī)鎖口。

1.4.4 滅菌 采用真空檢漏滅菌柜熱壓滅菌方式滅菌(工藝參數(shù)溫度121℃，時(shí)間20min)，

1.4.5 成品 產(chǎn)品放冷后轉(zhuǎn)入后續(xù)包裝工序貼標(biāo)、噴碼、裝盒、裝箱即得成品入庫(kù)。

1.5 口服液包裝優(yōu)點(diǎn)

本復(fù)方中藥制劑考慮采用口服液的劑型，鈉鈣玻璃藥瓶包裝，鋁制防盜蓋密封，安全衛(wèi)生，不會(huì)造成交叉污染、受潮結(jié)塊等狀況，更有以下優(yōu)點(diǎn)：有效成分分散在介質(zhì)中，分散度大、吸收快，能較迅速發(fā)揮作用；能減少成分的刺激性，生物利用度高；易于區(qū)分劑量，食用方便。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的確定

炙黃芪、人參、甘草、茯苓及熟地黃中均含多糖類成分，人參中含有大量的人參皂苷，淫羊藿主要含以淫羊藿苷為主的黃酮類成分，故確定本品的標(biāo)志性成分為粗多糖、總皂苷和淫羊藿苷。多糖類是極性較大的成分，水和稀醇作為溶媒對(duì)多糖類的提取效果較好；總皂苷的提取方法[4]使用較多的是水提煎煮法和醇提回流法，煎煮法得到的浸膏量較多，各物質(zhì)溶出效果好，而乙醇回流法提取皂苷率都在8%以上，皂苷含量高；淫羊藿苷根據(jù)其理化性質(zhì)，用乙醇溶液作為提取溶媒能更多地提取出淫羊藿苷，這也與趙燕燕[5]報(bào)道的淫羊藿苷提取條件篩選正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，最佳提取工藝為20倍量，70%乙醇提取3次，每次0.5h相符，但是本品為復(fù)方制劑，各原料配伍后綜合起效，所以提取條件不能簡(jiǎn)單地以淫羊藿苷提取量多少來(lái)確定。水提取法是既簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)的中藥口服液提取方法，且也符合中藥傳統(tǒng)的食用方法(水煎煮法)，而醇提法會(huì)損失絕大部分有益的多糖成分，因此本產(chǎn)品采用傳統(tǒng)的水提取法結(jié)合試驗(yàn)篩選，初步確定采用第1次加入10倍量水提取2h，第2次加入8倍量水提取1h，并對(duì)此條件進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，具體操作：稱取炙黃芪120g、淫羊藿80g、人參40g、熟地黃40g、茯苓40g、甘草20g共3份，分別加10倍、8倍量水提取2次，第1次提取2h，第2次提取1h，過(guò)濾，合并濾液，加熱濃縮，復(fù)配成成品并測(cè)定粗多糖、總皂苷和淫羊藿苷的提取量，結(jié)果見(jiàn)表1。

經(jīng)3批試驗(yàn)結(jié)果表明，傳統(tǒng)水提法工藝穩(wěn)定、可行，故確定提取工藝條件為：10倍量水提取2h，過(guò)濾；8倍量水提取1h，過(guò)濾；合并2次濾液。

表1 提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (mg/100mL)

2.2 標(biāo)志性成分的穩(wěn)定性

對(duì)口服液產(chǎn)品在37℃和相對(duì)濕度75%的恒溫恒濕箱中加速試驗(yàn)3個(gè)月，每月測(cè)定口服液中粗多糖、總皂苷、淫羊藿苷的含量，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的加速實(shí)驗(yàn)，標(biāo)志性成分的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

圖1 3個(gè)月加速試驗(yàn)中粗多糖含量變化

圖2 3個(gè)月加速試驗(yàn)中總皂苷含量變化

圖3 3個(gè)月加速試驗(yàn)中淫羊藿苷含量變化

本批次口服液經(jīng)過(guò)3個(gè)月的加速試驗(yàn)，標(biāo)志性成分含量都有所降低，其中粗多糖含量減少2.98%，總皂苷含量減少7.14%，淫羊藿苷含量減少2.93%，降幅不是很大，加速完成的產(chǎn)品中3項(xiàng)指標(biāo)含量分別為912mg/100mL、117mg/100mL、9.95mg/100mL，仍高于指標(biāo)要求，因此，該口服液中標(biāo)志性成分均有較好的穩(wěn)定性，在保質(zhì)期24個(gè)月中可以保證產(chǎn)品質(zhì)量。

2.3 滅菌工藝的驗(yàn)證

2.3.1 驗(yàn)證方法 使用121度壓力蒸汽滅菌生物指示劑(型號(hào)ATCC7953，嗜熱脂肪桿菌芽孢)嗜熱脂肪桿菌芽胞嗜熱脂肪桿菌芽胞做滅菌工藝驗(yàn)證。熱壓滅菌效果與滅菌時(shí)間、溫度、產(chǎn)品裝載密度等工藝條件有關(guān)，將滅菌時(shí)間設(shè)為10min、20min、30min，在水浴檢漏滅菌柜內(nèi)放置待滅菌產(chǎn)品，并在滅菌柜前后門處產(chǎn)品的上部、中部、下部各放置一支壓力蒸汽滅菌生物指示劑，溫度上升至T=121℃，工作壓力P=150kPa、滅菌時(shí)間參考工藝參數(shù)，降溫取出滅菌產(chǎn)品及生物指示劑，指示劑置于56～60℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取出觀察顏色變化，另取一支未經(jīng)滅菌的生物指示劑一起培養(yǎng)，作為陽(yáng)性對(duì)照。

2.3.2 結(jié)果判斷 在同一個(gè)滅菌器中采用不同的滅菌時(shí)間進(jìn)行3次滅菌試驗(yàn)，滅菌時(shí)間分別為10min、20min、30min。根據(jù)56～60℃ 培養(yǎng)48h后生物指示劑顏色判斷滅菌效果，培養(yǎng)后生物指示劑全部保持紫色則滅菌合格，如有一支由紫色變?yōu)辄S色則為不合格，對(duì)照管由紫色變?yōu)辄S色證明該指示劑有效。驗(yàn)證數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 不同滅菌時(shí)間對(duì)滅菌效果的影響驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 結(jié)論 121℃、10min滅菌不合格，證明這個(gè)條件下滅菌仍有風(fēng)險(xiǎn)，不宜采用，20min和30min的滅菌參數(shù)條件下，滅菌都是合格的，考慮到生產(chǎn)實(shí)際情況和能源消耗，采用121℃、20min滅菌工藝參數(shù)，并作重現(xiàn)性試驗(yàn)驗(yàn)證此工藝參數(shù)。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)論選擇滅菌時(shí)間20min，重復(fù)3次滅菌過(guò)程，生物指示劑放置的位置同之前的驗(yàn)證要求一致，驗(yàn)證滅菌效果的重現(xiàn)性。結(jié)果3次滅菌的生物指示劑經(jīng)56～60℃ 培養(yǎng)48h后，均未變色(保持紫色)，陽(yáng)性對(duì)照管變黃色，證明此滅菌條件的滅菌效果重現(xiàn)性良好，滅菌工藝條件穩(wěn)定可靠。

3 安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)及功能評(píng)價(jià)

檢測(cè)依據(jù)：衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[6]。

3.1 安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)

用本品口服液樣品制作濃縮液(濃縮比例10∶1)，無(wú)菌包裝，實(shí)驗(yàn)時(shí)以濃縮液原液作為受試物，以蒸餾水為溶媒將樣品配制成不同濃度的樣品液供試。

大小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，選用SD大鼠和ICR小鼠，采用最大耐受劑量法，設(shè)樣品40.0g/kg一個(gè)劑量組，經(jīng)口灌胃方式給受試物，觀察一般狀況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限為2周。染毒后，觀察期內(nèi)均未見(jiàn)大小鼠出現(xiàn)中毒和死亡狀況，雌雄兩性急性經(jīng)口最大耐受劑量均大于40.0g/kg體重，屬于無(wú)毒類。

用10倍濃縮液進(jìn)行Ames試驗(yàn)，試驗(yàn)菌株選用組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97 、TA98 、TA100 、TA102，結(jié)果為陰性，小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)，選用ICR小鼠，設(shè)樣品5.0、10.0和20.0g/kg體重三個(gè)劑量組，結(jié)果均為陰性，表明本品無(wú)致突變特性。

大鼠30天喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)樣品為產(chǎn)品的10倍濃縮液，設(shè)三個(gè)劑量組及陰性對(duì)照組，分別相當(dāng)于人推薦攝入量的25、50、100倍，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水稀釋成不同劑量濃度供試，大鼠選用SD大鼠80只，隨機(jī)分成四組，每組20只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠均未見(jiàn)異常癥狀和體征，也無(wú)死亡，各劑量組各項(xiàng)指標(biāo)均未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)，與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。

3.2 增強(qiáng)免疫力功能性試驗(yàn)評(píng)價(jià)

3.2.1 方法 供試樣品為產(chǎn)品的10倍濃縮液，產(chǎn)品人推薦劑量為40mL/60kg/日，相當(dāng)于產(chǎn)品的10倍濃縮液4mL/60kg/日。實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組和陰性對(duì)照組(蒸餾水)。低、中、高三個(gè)劑量為產(chǎn)品的10倍濃縮液0.33、0.67和2.0mL/kg體重，相當(dāng)于人推薦量的5倍、10倍和30倍。實(shí)驗(yàn)用清潔級(jí)ICR小鼠，雌性，體重(20±2)g。連續(xù)30～35天經(jīng)口給予不同劑量的受試樣品，陰性對(duì)照組給予蒸餾水。

3.2.2 結(jié)果 與陰性對(duì)照組比較，受試樣品低、中劑量組小鼠溶血空斑數(shù)均增加，差異均有顯著性；與陰性對(duì)照組比較，受試樣品中劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均升高，差異均有顯著性；與陰性對(duì)照組比較，受試樣品高劑量組ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和小鼠左后足跖部24h與0h厚度測(cè)量值差值均增加，差異均有顯著性。說(shuō)明本口服液具有增強(qiáng)免疫力的功能。

4 產(chǎn)品質(zhì)量控制

該產(chǎn)品按照以下質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格控制質(zhì)量，保障產(chǎn)品品質(zhì)。

4.1 感官評(píng)價(jià)

棕色至棕褐色液體，無(wú)肉眼可見(jiàn)外來(lái)雜質(zhì)，允許有少量沉淀，味苦回甘，具有原料中藥特有的氣味。

4.2 微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)≤50cfu/mL，大腸菌群≤6MPN/100mL，霉菌和酵母均≤10cfu/mL，致病菌皆不得檢出。

4.3 標(biāo)志性成分指標(biāo)

粗多糖含量(以葡萄糖計(jì))≥800mg/100mL，總皂苷(以人參皂苷Re計(jì))≥100mg/100mL，淫羊藿苷≥7.0mg/100mL。

4.4 理化指標(biāo)

可溶性固形物≥12g/100mL，pH為3.5～5.0，鉛含量(以Pb計(jì))≤0.5mg/kg，砷含量(以As計(jì))≤0.3mg/kg。

4.5 農(nóng)藥殘留指標(biāo)

六六六≤0.1mg/kg，滴滴涕≤0.1mg/kg。

5 討論

現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快使人們休息睡眠不足、超負(fù)荷工作、缺乏鍛煉，使疲勞和免疫力下降，慢性疾病增多。要預(yù)防或減少免疫力低下導(dǎo)致的疾病，除了要增強(qiáng)自我保健意識(shí)、養(yǎng)成良好的生活習(xí)慣外，采取一定的干預(yù)措施十分必要。保健食品具有一定的保健功能，且安全性高、可長(zhǎng)期服用，又可滿足人們?nèi)粘１＝〉男枨螅纱蟠笤鰪?qiáng)早期預(yù)防的意義和價(jià)值。

本制劑是針對(duì)免疫力下降綜合征，結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理研究成果，以藥食同源類或可用于保健食品的中藥炙黃芪、淫羊藿、人參、熟地黃、茯苓、甘草等為主要原料經(jīng)過(guò)提取濃縮、離心滅菌等工藝操作制成保健食品，經(jīng)過(guò)安全性毒理學(xué)試驗(yàn)證明屬于無(wú)毒性產(chǎn)品，經(jīng)功能學(xué)試驗(yàn)證明具有增強(qiáng)免疫力的保健功能，長(zhǎng)期食用可達(dá)到改善體質(zhì)、增強(qiáng)免疫力的功效。

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[6] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范[Z].2003.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2014-12-05

賈福懷(1963—)，男，寧波御坊堂生物科技有限公司高級(jí)工程師，研究方向?yàn)榻】诞a(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

陶剛(1984—)，男，寧波御坊堂生物科技有限公司工程師，研究方向?yàn)楸＝」δ苁称费邪l(fā)。

R284

A

1673-2197(2015)07-0021-03

10.11954/ytctyy.201507011