銀杏葉提取物對大鼠主動脈粥樣斑塊血管內(nèi)皮生長因子的影響

豐 飛,金偉東

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.南通大學(xué),江蘇 南通 226001)

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銀杏葉提取物對大鼠主動脈粥樣斑塊血管內(nèi)皮生長因子的影響

豐 飛1,金偉東2

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212001；2.南通大學(xué),江蘇 南通 226001)

目的：探討銀杏葉提取物對大鼠動脈粥樣斑塊中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法：將48只SD大鼠隨機分為四組：正常對照組大鼠12只；另建立動脈粥樣硬化大鼠模型36只，分為三組，每組12只:分為銀杏葉提取物組、辛伐他汀組、未干預(yù)組。干預(yù)4周后分別取胸主動脈組織，進行VEGF免疫組織化學(xué)檢查，再將所取主動脈組織進行VEGF的RT-PCR及Western-blot蛋白印跡分析。結(jié)果：正常對照組無VEGF表達,銀杏葉提取物組、辛伐他汀組VEGF表達明顯低于未干預(yù)組。銀杏葉提取物組和辛伐他汀組VEGF相對吸光度值顯著低于未干預(yù)組(P<0.05) 。結(jié)論：銀杏葉提取物可降低大鼠動脈粥樣硬化斑塊組織中VEGF表達，從而起到保護血管內(nèi)皮、穩(wěn)定粥樣斑塊的作用。

血管內(nèi)皮生長因子；銀杏葉提取物；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化斑塊形成與破裂所導(dǎo)致的急性心血管事件嚴(yán)重危害人類生命健康。據(jù)現(xiàn)有研究：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)對動脈粥樣硬化斑塊形成機制具有重要意義[1]。他汀類藥物對動脈粥樣硬化作用已得到廣泛認(rèn)同[2]，其機制之一與該類藥物能減少血管內(nèi)皮生長因子表達，從而保護血管內(nèi)皮，穩(wěn)定斑塊有關(guān)。銀杏葉提取物(ginkgo biloba extracts，GBE)含有天然有效成分黃酮醇苷(flavonoids glycosidic)和萜類內(nèi)酯(ginkgolide)[3]，在抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、保護內(nèi)皮細(xì)胞方面已有不少研究成果[4]。本實驗使用銀杏葉提取物干預(yù)大鼠動脈粥樣硬化模型，并與辛伐他汀干預(yù)進行比較，探討銀杏葉提取物是否具有減少血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達，減輕和穩(wěn)定動脈粥樣斑塊的作用及其相應(yīng)的機制。

1 材料與方法

1.1 基本物品準(zhǔn)備

1.1.1 實驗動物 選擇健康、成熟、8周齡雄性SD大鼠(rattus norvegicus)48只，體重為(200±20)g，由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 主要藥物、試劑及儀器 丙基硫氧嘧啶：南通精華制藥有限公司(50mg/片)。普通飼料、高脂飼料(含膽固醇、膽酸鈉、豬油、白糖等)：江蘇大學(xué)實驗動物中心提供。維生素D3：30萬U/支，上海通用藥業(yè)股份有限公司。銀杏葉提取物：銀杏葉片(成藥)，每片含有效成分黃酮醇苷9.6mg,萜類內(nèi)酯2.4mg，江蘇揚子江藥業(yè)集團有限公司。辛伐他汀(舒降之,20mg/片)：默沙東(中國)制藥有限公司。大鼠VEGF單克隆抗體：南京建成生物工程研究所。一步法RNA 聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒:Takara公司。721 型分光光度計:東方儀器廠。Smartscape生物顯微、電泳圖像處理系統(tǒng):奧林巴斯Olympus。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 實驗分組 48只雄性大鼠隨機分成四組，每組12只：①正常對照組：普通飼料喂養(yǎng)；②銀杏葉片組(GBE組)：高脂喂養(yǎng)+銀杏葉片；③辛伐他汀組：高脂喂養(yǎng)+辛伐他汀；④未干預(yù)組：高脂喂養(yǎng)，不加其他干預(yù)。

1.2.2 大鼠動脈粥樣硬化模型建立 參照既往研究，建立大鼠動脈粥樣硬化模型[5-6]：采用維生素D3[7]30萬U/kg體重腹腔注射加含3%膽固醇+0.5%膽酸鈉+0.2%丙基硫氧嘧啶+10%豬油+5%白糖和81.5%普通飼料的高脂飼料喂養(yǎng)，并于上述飼料喂養(yǎng)后第7天使用球囊損傷主動脈內(nèi)皮。喂養(yǎng)8周，Doppler超聲驗證主動脈斑塊形成。

1.2.3 藥物干預(yù) 銀杏葉片組每日喂服銀杏葉片0.5片/(kg·d)(每片含黃酮醇苷9.6mg,萜類內(nèi)酯2.4mg)；辛伐他汀組每日喂服辛伐他汀5.0mg/(kg·d)；高脂飲食組,生理鹽水灌胃。所有動物均自由飲水,最終取得完整資料者進入分析,共45只,銀杏葉片組11只,辛伐他汀組11只,未干預(yù)組11只,正常對照組12只。

1.2.4 標(biāo)本收集與處理 所有大鼠用氯胺酮麻醉后，打開胸腔，剪取主動脈弓至膈肌以上主動脈1.5～2cm，將胸主動脈標(biāo)本立即投入10%甲醛液固定，在病理人員協(xié)助下制作主動脈切片，HE染色。同時取新鮮的血管組織標(biāo)本,利用大鼠VEGF單克隆抗體行VEGF免疫組織化學(xué)檢查,以PBS代替VEGF單克隆抗體作為陰性對照,請兩位病理學(xué)專業(yè)人員在事先未告知實驗情況的前提下對各組免疫組織化學(xué)染色最顯著區(qū)域VEGF信號強度進行分級:陰性、弱陽性和強陽性。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)步驟：組織總RNA一步法提取。

Western-Blot蛋白印跡分析：制作組織勻漿液，并加入蛋白裂解液,各樣本4℃高速離心20min,定量后各取等量樣本行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,封閉液封閉1h。將膜與一抗共同孵育90min,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗共同孵育45min,加等體積增強發(fā)光化學(xué)試劑孵育1min。在暗室將膜在感光膠片上曝光并用相紙顯影洗像,調(diào)整曝光時間直至顯影出電泳帶,采用生物電泳圖像處理系統(tǒng)對免疫復(fù)合物進行分析。以β-actin 作為內(nèi)參照,以各組產(chǎn)物吸光度值與β-actin 吸光度值的比值作為各組產(chǎn)物相對吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)檢查結(jié)果

蘇木精-伊紅染色(HE)結(jié)果：正常對照組(圖1)大鼠主動脈光鏡下見內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)膜光滑,未見脂紋,內(nèi)膜、中膜和外膜分界清楚;中膜主要由呈同心排列的彈性纖維膜組成，基質(zhì)內(nèi)可見有環(huán)形的平滑肌細(xì)胞;外膜較薄，為疏松結(jié)締組織，內(nèi)含少量平滑肌細(xì)胞。未干預(yù)組(圖2)內(nèi)膜增厚 ,透明變性,粥樣斑塊隆起,斑塊內(nèi)可見脂質(zhì)沉積和大量泡沫細(xì)胞,中膜彈力纖維和膠原纖維形態(tài)較紊亂。銀杏葉提取物組(圖3)、辛伐他汀組(圖4)均未見明顯粥樣斑塊，內(nèi)膜增生程度低于未干預(yù)組,中膜彈力纖維和膠原纖維形態(tài)優(yōu)于未干預(yù)組。

圖1 正常對照組(300×) 圖2 未干預(yù)組(300×)

圖3 銀杏葉提取物組(300×) 圖4 辛伐他汀組(300×)

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

正常對照組主動脈則未見VEGF 陽性表達(圖5)。未干預(yù)組(圖6)粥樣斑塊區(qū)可見密集分布的染成棕色不規(guī)則斑點的VEGF陽性表達信號,銀杏葉提取物組(圖7)、辛伐他汀組(圖8)粥樣斑塊不明顯，VEGF陽性表達信號的棕黃色斑點顯微鏡下觀察已不明顯。銀杏葉提取物組、辛伐他汀組與未干預(yù)組比較，有顯著差異(P<0.001)，VEGF信號強度弱于未干預(yù)租；而銀杏葉提取物組與辛伐他汀組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖5 正常對照組(300×) 圖6 未干預(yù)組(300×)

2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果

正常對照組無擴增產(chǎn)物表達,銀杏葉提取物組、辛伐他汀組可見擴增產(chǎn)物模糊條帶,未干預(yù)組則呈現(xiàn)強亮度條帶,擴增產(chǎn)物大小為380 bp (圖9) 。未干預(yù)組條帶亮度明顯高于銀杏葉提取物組、辛伐他汀組。銀杏葉提取物組、辛伐他汀組吸光度值分別與未干預(yù)組比較，差異顯著(P<0.001),銀杏葉提取物組、辛伐他汀組相對吸光度值相比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

圖7 銀杏葉提取物組(300×) 圖8 辛伐他汀組(300×)

組別強陽性弱陽性陰性合計GBE組?010111辛伐他汀組?07411未干預(yù)組110011正常對照組001212合計11171745

注：與未干預(yù)組比較，*P<0.001。

圖9 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)分析結(jié)果

2.4 Western-Blot蛋白印跡分析結(jié)果

正常對照組無VEGF表達,銀杏葉提取物組、辛伐他汀組及未干預(yù)組均可見不同密度VEGF表達(圖10) ：未干預(yù)組VEGF信號強度明顯高于銀杏葉提取物組和辛伐他汀組。銀杏葉提取物組、辛伐他汀組吸光度值分別與未干預(yù)組比較，差異顯著(P<0.001),銀杏葉提取物組、辛伐他汀組相對吸光度值比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

圖10 Westen Blot 蛋白印跡分析結(jié)果

表2 各組血管內(nèi)皮生長因子逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和Western-Blot產(chǎn)物相對吸光度值變化 (±s)

注：與未干預(yù)組比較，*P<0.001。

3 討論

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促進血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長因子,在血管新生過程中具有重要意義,抑制VEGF 在動脈粥樣斑塊中的表達可一定程度地控制斑塊生長進程[8]。

VEGF在血管發(fā)育、重構(gòu)和成熟過程中起重要的調(diào)控作用：VEGF可通過炎癥浸潤和新生血管形成等機制促進動脈粥樣硬化損傷的發(fā)展，與斑塊的不穩(wěn)定性有密切關(guān)系[9]。Chen等[10]研究證實，在粥樣斑塊平滑肌及巨噬細(xì)胞中，都有VEGF的強表達。VEGF陽性細(xì)胞數(shù)目與內(nèi)膜血管化程度正相關(guān)，且VEGF陽性細(xì)胞分布與新生血管分布高度一致，即主要位于斑塊肩部和纖維帽部。在血流剪切力的作用下，斑塊的上述部分易發(fā)生破裂，導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生。進一步研究斑塊損傷區(qū)域VEGF，將為穩(wěn)定粥樣斑塊，預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生提供新的研究方向。

目前關(guān)于他汀類藥物對粥樣斑塊穩(wěn)定性影響的研究很多[11],銀杏葉提取物防治動脈粥樣硬化中的機制也不再局限于抗氧化，調(diào)節(jié)血脂[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：銀杏葉提取物和辛伐他汀均能夠明顯降低VEGF 在大鼠主動脈粥樣斑塊中的表達,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和Western-Blot 蛋白印跡分析從mRNA 水平和蛋白質(zhì)水平進一步證實了上述結(jié)果。可見銀杏葉提取物和辛伐他汀可通過降低VEGF 在粥樣斑塊中的表達，在一定程度上抑制血管新生,這與他汀抑制血管新生的報道結(jié)果一致[13]。

本實驗驗證了銀杏葉提取物對粥樣斑塊內(nèi)VEGF表達的下調(diào)作用，而VEGF水平的下降能夠起到穩(wěn)定粥樣斑塊，防止斑塊破裂作用。近年來國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可通過多種作用機制抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[14]。銀杏葉提取物作為眾多治療動脈粥樣硬化的天然藥物中療效較為突出的藥物，值得進一步研究。

[1] 章燕幸，陳懷紅.血管內(nèi)皮生長因子與動脈粥樣硬化[J].國際腦血管病雜志，2006，14(6)：452-455.

[2] 尚可，袁展群.辛伐他汀對動脈粥樣硬化大鼠的干預(yù)作用及機制[D].南昌：南昌大學(xué)， 2008.

[3] 唐慧勤，王乃平，張玉萌.中藥抗動脈粥樣硬化作用機制的研究進展[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2006，3(3)：14.

[4] 徐艷芬，張麗娟，宋新波.銀杏葉提取物研究進展[J].藥物評價研究，2010，33(6):452-456.

[5] 楊軍珂，郭延松，吳宗貴，等.一種大鼠動脈粥樣硬化斑塊模型的建立[J].中國心血管雜志，2004，9(5)：353-356.

[6] 郭延松，吳宗貴，楊軍珂，等. 三種大鼠動脈粥樣硬化模型復(fù)制方法的比較[J].中國動脈硬化雜志，2003，11(5)：465-469.

[7] 劉磊，焦向英，張煒芳，等.高脂飼料及維生素D3聯(lián)合應(yīng)用建立大鼠動脈粥樣硬化模型[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，36(6)：681-684.

[8] ALAN NT, KEVIN GP, MICHAEL HS, et al.Neovascularization in atherectomy specimens from patients with unstable angina:Implications for pathogenesis of untable angina[J].American Heart Journal,1998, 135(1):10-14.

[9] 趙仙先，朱家麟，張寶仁，等.血管內(nèi)皮生長因子在動脈粥樣硬化斑塊中的表達[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1999，20(9):669-671.

[10] CHEN YX, NAKASHIMA Y, TANAKA K,et al. Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in atherosclerotic intimas of human coronary arteries[J].Arteoscler Thromb Vasc Bio,1999,19(1):131-139.

[11] 張敏,陳楨月,陸國平，等.辛伐他汀對內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-2304 細(xì)胞分化抗原40 誘導(dǎo)表達的影響[J].中國動脈硬化雜志，2003,11(3):234-237.

[12] 牟冷麗，寇俊萍，朱丹妮，等.銀杏葉提取物的化學(xué)成分及其抗氧化活性[J].中國天然藥物，2008，6(1)：26-28.

[13] VINCENT L, SORIA C, MIRSHAHI F,et al. Cerivastatin, an inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase,inhibits endothelial cell proliferation induced by angiogenic factors in vitro and angiogenesis in in vivo models[J].Arteoscler Thromb and Vasc Bio,2002,22(4):623-629.

[14] 萬冬宇，黃維義.銀杏葉提取物抗動脈粥樣硬化作用機制的研究進展[J].心血管病學(xué)進展，2010,31(1)：131-133.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Effects of Ginkgo Biloba Extracts on VEGF of Atherosclerotic Aortic Plague of Rat

Feng Fei1，Jin Weidong2

(1.Jiangsu University Affiliated Hospital , Zhenjian 212001,China; 2.Nantong University, Nantong 226001, China)

Objective:The aim of this study is to demonstrate whether GBE has the effect that decrease VEGF in the plaque of atherosclerotic rat.Methods:Duplication of atherosclerotic rat , 36 atherosclerotic rats were randomly divided into 3 groups:12 intervened by GBE,12 intervened by simvastatin and 12 without drug intervention for another 4 weeks.Then the rats were executed to take specimens from aorta HE staining and immunohistochemistry assay to observe the expression of VEGF. At the same time ,specimens were taken into RT-PCR and Western-blot.Results:No VEGF was expressed in normol group. Non-intervention group had stronger density expressing VEGF than the drug intervention groups .The relative absorbency of GBE group and simvastatin group is lower than that of non intervention group(P<0.05).Conclusion:GBE can reduce the expression of VEGF so as to protect the blood vessel endothelium cell and stabilify the plaque.

Vascular Endothelial Growth Factor；Ginkgo Biloba Extracts；Atherosclerosis

2014-11-07

豐飛(1976-)，男，江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院主治醫(yī)師，研究方向為急性心血管病的治療。

R285.5

A

1673-2197(2015)07-0005-03

10.11954/ytctyy.201507003