納豆激酶抗腦缺血作用及機(jī)制研究

于 良,馬菁纓，高 靜，劉學(xué)陽，紀(jì)紅蕊

(哈爾濱理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院/綠色化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

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納豆激酶抗腦缺血作用及機(jī)制研究

于 良,馬菁纓，高 靜，劉學(xué)陽，紀(jì)紅蕊*

(哈爾濱理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院/綠色化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討納豆激酶(NK)腦保護(hù)作用的具體機(jī)制。方法：通過制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)致缺血模型，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)、紫外分光光度法研究納豆激酶對(duì)MCAO大鼠血小板內(nèi)cAMP含量、對(duì)酪氨酸激酶1/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子1(JAK1/STAT1)通路表達(dá)、對(duì)腦組織SOD和MDA的影響；采用熒光分光光度法檢測(cè)了NK對(duì)凝血酶刺激后人刺激酶小板內(nèi)鈣動(dòng)員動(dòng)脈阻塞血小板內(nèi)鈣離子濃度變化。結(jié)果：NK顯著增加MCAO大鼠血小板內(nèi)cAMP含量，同時(shí)激活損傷部位的JAK1/STAT1通路發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，顯著提升了腦組織SOD酶的活力、顯著降低了MDA的含量；在體外，抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板內(nèi)鈣離子濃度的增加。結(jié)論：NK抗腦缺血作用的機(jī)制可能為以下幾點(diǎn)：升高環(huán)腺苷酸含量、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣釋放產(chǎn)生抗血小板活化作用；提高機(jī)體清除自由基的能力，降低脂質(zhì)過氧化物的含量而抗自由基損傷；激活JAK1/STAT1通路產(chǎn)生抗凋亡作用。

納豆激酶；環(huán)腺苷酸；酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子；自由基

血栓栓塞性疾病是目前全球死亡率占首位的病癥，嚴(yán)重危害中老年人生命和健康，且呈年輕化趨勢(shì)，其發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。近年來，抗血栓藥物的研究和開發(fā)受到廣泛關(guān)注，預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病已經(jīng)成為當(dāng)前醫(yī)藥界亟待解決的問題。納豆激酶(nattokinase,NK)是具有溶解血栓的主要成分——纖維蛋白功能的一種絲氨酸蛋白酶，最初由日本學(xué)者須見洋行在納豆中發(fā)現(xiàn)并命名[2]。與傳統(tǒng)的抗血栓藥物相比，NK具有安全性高、成本低、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、可口服、體內(nèi)半衰期長等優(yōu)點(diǎn)，有望成為新一代溶栓藥物[3]。目前，NK的研究主要集中在高產(chǎn)菌株的篩選和發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化等方面，而其抗腦缺血發(fā)揮腦保護(hù)作用方面的研究少有報(bào)道，本研究分別從第二信使、細(xì)胞內(nèi)鈣、自由基損傷、信號(hào)通路等幾方面探討NK對(duì)腦組織的保護(hù)作用，旨在為其合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Wistar大鼠，雄性，體重250～300g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

納豆激酶膠囊(榮成百合生物技術(shù)有限公司)；蚓激酶腸溶片(長春遠(yuǎn)大國奧制藥有限公司)；蛋白定量測(cè)試盒、SOD測(cè)定試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒(南京建成科技有限公司)； cAMP試劑盒(美國Cayman chemical公司);fluo-3鈣離子染料(Invitrigen公司)，凝血酶(Thrombin)、Apyrase(BioLabs公司)；EGTA、Hepes(Amresco公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

opticon2實(shí)時(shí)定量PCR儀(biorad公司)，T6紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，JY 92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，TGL-18C高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，GF-F3000酶標(biāo)儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)，F(xiàn)-4500型熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性藥蚓激酶組(0.4萬單位·d-1)、NK高劑量組(9.4mg·d-1)、NK低劑量組(4.7mg·d-1)組，藥物均溶解于生理鹽水中，給藥組動(dòng)物分別于再灌注6h之內(nèi)、24h、48h，經(jīng)口給藥，末次給藥后4h內(nèi)處死大鼠，取血，取腦；假手術(shù)組與模型組給予等量的生理鹽水，分別在再灌注24h處死大鼠，取血，取腦。

2.2 大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制備

Wistar大鼠水合氯醛(10%，0.35mg/kg)麻醉后，仰臥固定，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(interal carotid artery，ICA)及頸外動(dòng)脈(exteral carotid artery，ECA)，結(jié)扎ECA與CCA，用動(dòng)脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端后，迅速于距ECA與ICA分叉處約0.5cm的頸總動(dòng)脈處作一切口，插入一端涂有石蠟的漁線(直徑為0.234mm)，插入深度為(18.5±0.5)mm，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎入口處，漁線外留約1cm，縫合皮膚。2h后輕輕提拉所留線頭至略有阻力以實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注。在缺血2h和再灌注時(shí)間內(nèi)用電熱毯維持大鼠肛溫在36.5～37.5 ℃。假手術(shù)組大鼠分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，但只結(jié)扎CCA。

大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞形成缺血，2h后實(shí)現(xiàn)再灌注，模型穩(wěn)定24h后，處死大鼠，迅速取腦取血。

2.3 大鼠洗滌血小板制備

大鼠固定后，從其右側(cè)頸總動(dòng)脈取血，檸檬酸鈉(3.8%，1∶9v/v)抗凝，800rpm離心20min，取上清得富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)，加入apyrase 1μL/mL，PRP 2 000rpm離心10min，沉淀用含0.35% BSA的Tyrode's buffer懸浮，然后用Tyrode's buffer洗滌2次，最后血小板用勻漿緩沖液重懸，得洗滌血小板(washed platelet，WP)，調(diào)整血小板計(jì)數(shù)為3.0×108/mL，置-80℃保存。

2.4 NK對(duì)MCAO大鼠腦組織SOD、MDA的影響

各不同處理組大鼠再灌注24h后，脫臼處死，取右腦大腦皮層組織，用冰冷的生理鹽水制備10%的腦組織勻漿，3 000r/min離心10min。上清液-20℃冷凍保存。按照試劑盒說明書分別在595nm 、532nm處，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)腦組織SOD活力、MDA含量進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 ELLSA法檢測(cè)NK對(duì)MCAO大鼠洗滌血小板cAMP含量的變化

冰凍保存的WP用超聲破碎儀粉碎，30sec/mL，勻漿產(chǎn)物2 500rpm離心10min，取上清。上清適當(dāng)稀釋后按照試劑盒說明用乙酰化ELISA法檢測(cè)cAMP含量。

2.6 Real-Time PCR法檢測(cè)NK對(duì)大鼠腦組織JAK1/STAT1表達(dá)的變化

使用Trizol法對(duì)腦組織RNA 進(jìn)行提取，電泳檢查RNA的完整性，紫外分光光度儀測(cè)出每個(gè)樣品RNA的濃度后，用Rnase Free H2O稀釋至濃度為1μg/μL。引物序列見表1。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和定量PCR。反應(yīng)條件為：95℃，10min；95℃，10s；60℃，10s；72℃，30s。共35cycles。制作擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、融解曲線，記錄數(shù)值，使用JAK1/STAT1均一化數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表1 引物設(shè)計(jì)及合成

2.7 熒光分光光度法檢測(cè)NK對(duì)Thrombin 誘導(dǎo)人血小板內(nèi)鈣離子變化的影響

制備正常健康志愿者的PRP(含apyrase 1μL/mL)，PRP 2 000rpm離心10 min，得到的片狀沉淀用無鈣的Hepes buffer洗滌2次，重懸，得洗滌血小板(WP)，調(diào)整血小板計(jì)數(shù)為2×109/mL。加入BSA(終濃度為1.5g/L)，WP于37℃與fura-3/AM (5μmol/L，溶解于DMSO)孵育40min，然后懸浮于無鈣的Hepes buffer，終濃度為2×106platelets/mL。懸浮的WP分別進(jìn)行如下處理，誘導(dǎo)組：WP與0.5U/mL的thrombin在37℃孵育4min；NK的25μg/mL,50μg/mL和100μg/mL劑量組分別先與WP在37℃孵育10min，再加入0.5U/mL的thrombin于37℃共同孵育4min。之后，不同處理組的WP離心、洗滌、重懸。使用F-4500型熒光分光光度計(jì)測(cè)量鈣離子的濃度，發(fā)射波長：506nm，分別記錄激發(fā)波長在400～800nm的數(shù)值。

按照下面公式(1)計(jì)算Ca含量，其中，[Ca2+]Free為游離鈣離子的濃度，Kd為Fluo-3Ca2+的有效解離常數(shù)，在生理?xiàng)l件下其值為325nmol/L；F、Fmax和Fmin均為λex=506nm、λem=460nm時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度；F為Fluo-3與細(xì)胞溫育后細(xì)胞懸液的熒光強(qiáng)度；Fmax為最大熒光強(qiáng)度,即細(xì)胞懸液在測(cè)定F值后，加入Triton X-100破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)尚未與Ca2+結(jié)合的Fluo-3被Ca2+完全飽和所測(cè)得的熒光強(qiáng)度；Fmin為最小熒光值,即細(xì)胞懸液在測(cè)定Fmax值后，加入EGTA配合溶液中全部Ca2+，使Fluo-3呈游離狀態(tài)所測(cè)得的熒光強(qiáng)度。

公式(1)

懸浮于含鈣的Hepes buffer中的WP操作同上，同樣記錄其在激發(fā)波長400～800nm的數(shù)值，記錄[Ca2+]i。

2.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差進(jìn)行分析，以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用SNT方法比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 NK對(duì)MCAO鼠腦組織SOD、MDA的作用

由表2可以看出，經(jīng)SPSS13.0軟件分析，與模型組比較，假手術(shù)組、NK高劑量組、LK組的SOD酶活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，而MDA含量顯著下降，且NK高劑量組和LK組無顯著性差異。

表2 NK 對(duì)MCAO鼠腦組織SOD 和MDA 的作用 (±s，n=5)

注:與模型組比較，*P<0.05。

3.2 NK對(duì)MCAO鼠洗滌血小板cAMP含量的影響

采用ELISA法檢測(cè)洗滌血小板內(nèi)cAMP含量，經(jīng)ANOVA分析，與模型組相比較，高劑量NK、低劑量NK均可使血小板內(nèi)cAMP含量顯著升高。且高劑量NK組與LK組相比較無顯著性差異。

表3 NK對(duì)MCAO鼠血小板cAMP含量的影響 (±s，n=5)

注:與模型組比較，*P<0.05。

3.3 NK對(duì)MCAO大鼠腦組織JAK1、STAT1 PCR表達(dá)的影響

采用Real-Time PCR法分析了NK對(duì)缺血再灌注大鼠腦組織JAK1/STAT1的影響，其擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、融解曲線結(jié)果良好，使用JAK1/STAT1均一化數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，與模型組JAK1相比較，假手術(shù)組顯著下降，NK高劑量、中劑量、LK組均顯著升高，并且NK高劑量組與LK組無顯著性差異。與模型組STAT1相比較，假手術(shù)組顯著下降，NK高劑量顯著下降，見表4。

表4 NK對(duì)MCAO大鼠腦組織JAK、STAT1 PCR表達(dá)的影響 (±s，n=4)

注:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 NK對(duì)人洗滌血小板Ca2+含量的影響

在血小板活化過程中，鈣離子動(dòng)員起到了關(guān)鍵的作用，因此檢測(cè)了NK對(duì)Thrombin誘導(dǎo)人血小板內(nèi)鈣離子變化的影響。在含鈣Hepes buffer中，與凝血酶誘導(dǎo)組鈣離子濃度相比，空白對(duì)照組顯著降低，NK高中劑量組預(yù)處理10min，顯著降低，見表5。此外，還檢測(cè)了無鈣Hepes buffer中NK對(duì)Thrombin 誘導(dǎo)大鼠血小板內(nèi)鈣離子的變化，凝血酶誘導(dǎo)鈣離子濃度值與含鈣Hepes buffer中相比無顯著性差異(P>0.05)，比較NK對(duì)細(xì)胞外液中含Ca2+和不含Ca2+時(shí)[Ca2+]i的影響，結(jié)果無顯著差異(P>0.05)。

表5 在含鈣液中NK對(duì)人洗滌血小板Ca2+含量的影響 (±s，n=5)

注:與凝血酶誘導(dǎo)組比較，**P<0.01。

4 討論

SOD對(duì)于機(jī)體防御內(nèi)、外環(huán)境中自由基損傷起著重要作用，是衡量自由基基礎(chǔ)代謝狀態(tài)的重要指標(biāo)。MDA水平升高，SOD活性降低，即可引發(fā)氧化應(yīng)激過程，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受到損害甚至細(xì)胞死亡[4]。NK高劑量組中MDA含量顯著下降和SOD活力增強(qiáng)，說明NK能夠抗細(xì)胞損傷，防止氧化應(yīng)激的發(fā)生。

有研究表明，蛋白酪氦酸激酶JAKl在哺乳動(dòng)物大腦的發(fā)育和成熟階段能夠持續(xù)表達(dá)[5-6]。JAK-STAT通路的確對(duì)前腦的發(fā)育過程起到了重要作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)大鼠腦組織中JAKl、STATl均有發(fā)現(xiàn)，但缺血再灌注損傷后能進(jìn)一步表達(dá)，模型組大鼠表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，提示腦缺血再灌注損傷可誘發(fā)JAKl、STAT1的表達(dá)，它們的高表達(dá)，表明它們可能與腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞生存與凋亡的基因調(diào)控過程有關(guān)，目前主要認(rèn)為JAKl和抗細(xì)胞凋亡有關(guān)，而STATl與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。推測(cè)NK可能通過誘導(dǎo)JAKl mRNA高表達(dá)發(fā)揮其抗凋亡作用，通過降低STAT1mRNA表達(dá)而減輕其誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡作用，從而保護(hù)缺血神經(jīng)元的損傷。

環(huán)核苷酸(cAMP)是重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，血小板的活化往往伴隨著胞漿環(huán)核苷酸水平的降低，通過提升其內(nèi)的環(huán)核苷酸水平可抑制血小板聚集[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NK高中劑量組均可以顯著提高血小板cAMP水平，從而達(dá)到抑制血小板聚集的作用。

綜上所述，通過體內(nèi)體外研究，我們發(fā)現(xiàn)NK可以提升機(jī)體清除自由基的能力；可以激活大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型損傷部位的JAK1 mRNA的表達(dá)、抑制STAT1 mRNA的表達(dá)；可以直接通過升高大腦中動(dòng)脈阻塞模型鼠血小板cAMP含量、抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板內(nèi)鈣離子濃度的升高而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

[1] STRONG K,MATHERS C,BONITA R.Preventing stroke:saving lives around the world[J].Lancet Neurology,2007,6(2):182-187.

[2] SUMI H,HAMADA H,TSUSHIMA H,et al.Anovel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto;a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia.,1987,43(20):1110-1111.

[3] FUJITA M,OHNISHI K,TAKAOKA S,et al.Antihypertensive effects of continuous oral administration of nattokinase and its fragments in spontaneously hypertensive rats.biol.pharm[J].Bull,2011,34(11):1696-1701.

[4] DEMIR I,KIYMAZ N,GUDU BO,et al.Study of the neuroprotective effect of ginseng on superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) levels in experimental diffuse head trauma[J].Acta Neurochirurgica,2013,155(5):913-922

[5] JASON SR,KRISTIN MR,DOUGLAS AH.The JAK/STAT signaling pathway[J].J Cell Sci,2004,117(Pt8):1281-1283.

[6] DEBRA LS,ERIKA RG,DENISE JM.Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila[J].Development,2005,132(15):3483-92.

[7] FLAHERTY MS,SALIS P,EVANS C,et al.Chinmo is a functional effector of the JAK/STAT pathway that regulates eye development,tumor formation,and stem cell self-renewal in Drosophila[J].Dev Cell,2010,18(4):556-568.

[8] BHATTACHARYYA M,KARMOHAPATRA SK,BHATTACHARYA G,et al.The role of leucocytes in the acetyl salicylic acid (aspirin) induced nitric oxide synthesis in the production of interferon-α,a potent inhibitor of platelet aggregation and a thrombolytic agent[J].Journal of Thrombosis and Thrombolysis,2009,28(2):173-184.

[9] GUPTA S,REVIAKINE I.Platelet activation profiles on TiO2:effect of Ca2+binding to the surface[J].Biointerphases,2012,7(1-4):1-12.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2015-06-02

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(12521078)

于良(1994-),男，哈爾濱理工大學(xué)在讀生，研究方向?yàn)樾难芩幚韺W(xué)、毒理學(xué)。

紀(jì)紅蕊(1978-)，女，哈爾濱理工大學(xué)博士研究生，研究方向?yàn)樾难芩幚韺W(xué)、毒理學(xué)。E-mail：jihongrui720@126.com

R743.33

A

1673-2197(2015)21-0010-03

10.11954/ytctyy.201521004