麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合抗生素體外抗肺炎克雷伯菌作用研究

楊 露,謝曉芳,胡 榮

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 圖書館， 四川 成都 610075； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 測(cè)試中心，四川 成都 611137)

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麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合抗生素體外抗肺炎克雷伯菌作用研究

楊 露1,謝曉芳2,胡 榮2

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 圖書館， 四川 成都 610075； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 測(cè)試中心，四川 成都 611137)

目的：研究麻黃附子細(xì)辛湯與抗生素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)抗生素的增效作用。方法：將各組培養(yǎng)基分別接種肺炎克雷伯菌后37℃培養(yǎng)過(guò)夜，空白組不接種細(xì)菌，每12h取出計(jì)數(shù)，計(jì)算活菌數(shù)。結(jié)果：中藥復(fù)方組12h時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌逐漸生長(zhǎng)，直至培養(yǎng)120h后細(xì)菌濃度才逐漸下降，培養(yǎng)180h時(shí)細(xì)菌濃度保持不變;頭孢唑林組培養(yǎng)12h時(shí)細(xì)菌數(shù)逐漸減少，到60h時(shí)細(xì)菌減少的趨勢(shì)停止；中藥復(fù)方聯(lián)合頭孢唑林組培養(yǎng)12h時(shí)細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，并在培養(yǎng)144h時(shí)各組細(xì)菌無(wú)生長(zhǎng)跡象,替加環(huán)素藥物干預(yù)后細(xì)菌數(shù)急劇下降，但是直到觀察結(jié)束仍有部分細(xì)菌存活；陰性組細(xì)菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢生長(zhǎng)趨勢(shì)；空白組無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)論：麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合抗生素具有更明顯的抗菌效應(yīng)，可能與它激活耐藥細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)。

麻黃附子細(xì)辛湯；抗肺炎；克雷伯菌；抗生素；細(xì)菌生長(zhǎng)；抗菌

抗生素的廣泛使用甚至濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)峻，雖然針對(duì)耐藥菌研發(fā)新型抗生素的工作從未停止，但是抗生素資源是相對(duì)有限的，新型抗生素的開(kāi)發(fā)速度遠(yuǎn)不及細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的速度。肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)是一種存在于人體上呼吸道和腸道的革蘭氏陰性桿菌，近年來(lái)已成為引起社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院感染的最重要病原菌之一[1]。由于大量抗生素的廣泛使用，KP已成為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的代表菌種，耐藥性問(wèn)題日益突出[2]。有研究表明，KP對(duì)頭孢唑林的耐藥率達(dá)33.5%[3]。麻黃附子細(xì)辛湯是漢代張仲景的《傷寒論》中的經(jīng)典方劑，由麻黃、附子、細(xì)辛三味藥組成，具有助陽(yáng)解表、溫化寒飲之功效[4]，其組方嚴(yán)謹(jǐn)，日本島根縣疑難病研究所的龜井勉主任在日本《醫(yī)學(xué)論壇報(bào)》上報(bào)告稱，在治療老年人耐藥菌感染時(shí)，用麻黃附子細(xì)辛湯取得了較好效果。國(guó)內(nèi)也有報(bào)道用麻黃附子細(xì)辛湯治療肺炎遷延不愈，其中不乏住院后感染的老年病例 ，癥狀與克雷伯菌感染相似[5]。多項(xiàng)研究已證實(shí)該方具有明顯的抗病毒、消炎、刺激免疫等作用，但其抗菌機(jī)制尚未明確，近年來(lái)有文獻(xiàn)[6]指出“休眠”并非細(xì)菌耐藥的唯一原因，緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌耐藥性雖然稍低于“休眠”細(xì)菌，但由于其數(shù)量龐大，是造成抗生素失效以及感染復(fù)發(fā)的主要原因。于是我們猜想：麻黃附子細(xì)辛湯發(fā)揮抗菌效應(yīng)是否與在一定程度上促進(jìn)耐藥菌生長(zhǎng)有關(guān)？為了證實(shí)這一假設(shè)，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，我們做了實(shí)驗(yàn)研究，具體如下。

1 材料及儀器

1.1 藥品及菌種

麻黃(內(nèi)蒙古,批號(hào)121001)，細(xì)辛(遼寧,批號(hào)121102)，附子(四川,批號(hào)120801)，經(jīng)鑒定均為正品。肺炎克雷伯菌來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，由成都中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室鑒定、保存。

1.2 儀器

隔水式電熱細(xì)胞(霉菌)培養(yǎng)箱(常州華冠儀器制造有限公司)，凈化工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(深圳市耐美特工業(yè)設(shè)備有限公司)，自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(上海茸研儀器有限公司)，PL 203型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 培養(yǎng)基

M-H液體培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司，批號(hào)：113627)；胎牛血清(鄭州佰安生物工程有限公司，批號(hào)：03514)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA，規(guī)格：250g，西亞試劑在生物制藥有限公司，批號(hào)：20120205)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB，規(guī)格：250mL，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，貨號(hào)：YH00624)。所有培養(yǎng)基均按產(chǎn)品說(shuō)明書配制。

1.4 抗生素

頭孢唑林(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 20045015，悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；加環(huán)素(國(guó)藥準(zhǔn)字：20041889，天津百特醫(yī)療用品有限公司)。

2 方法

2.1 分組

將培養(yǎng)基分為麻黃附子細(xì)辛湯復(fù)方組、中藥復(fù)方加頭孢唑林組、頭孢唑林組、空白組(未加藥物，未接種細(xì)菌的空白培養(yǎng)基)，陽(yáng)性組(單純加入替加環(huán)素的培養(yǎng)基)、陰性組(未加藥物，接種細(xì)菌的培養(yǎng)基)。

2.2 復(fù)方提取

將附子、麻黃、細(xì)辛分別粉碎成直徑小于18μm的超微粉，分別精密稱取12g、6g、6g，冷水浸泡后煎煮2次，合并煎煮液，過(guò)濾，濃縮為50mg(生藥)/mL。

將0.9%NaCl溶液煮沸滅菌，置于4°C環(huán)境中備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)利用經(jīng)過(guò)滅菌的0.9%NaCl溶液將受試樣本溶液配制成不同濃度梯度的液體。

2.2 細(xì)菌液的制備

將肺炎克雷伯菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，并靜置于37℃條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，隨后取出細(xì)菌液3mL，利用營(yíng)養(yǎng)肉湯將細(xì)菌液濃度稀釋成(0.5～1)×105個(gè)/mL密度備用。

2.3 活菌計(jì)數(shù)

將不同組別的培養(yǎng)基分別接種肺炎克雷伯菌后混勻，冷卻，待凝固后，放入37℃培養(yǎng)過(guò)夜，每12h計(jì)數(shù)，觀察比較耐藥菌的生長(zhǎng)情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將所得數(shù)據(jù)輸入EXCEL表格中，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，方差分析前采用Levene檢驗(yàn)方差齊性。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

中藥復(fù)方組12h時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌逐漸生長(zhǎng)，直至培養(yǎng)120h后細(xì)菌濃度才逐漸下降，直至培養(yǎng)180h時(shí)細(xì)菌濃度保持不變；頭孢唑林組培養(yǎng)12h時(shí)細(xì)菌數(shù)逐漸減少，到60h時(shí)細(xì)菌減少的趨勢(shì)停止；中藥復(fù)方聯(lián)合頭孢唑林組培養(yǎng)12h時(shí)細(xì)菌數(shù)逐漸減少，并在培養(yǎng)144h時(shí)各組細(xì)菌無(wú)生長(zhǎng)跡象。替加環(huán)素藥物干預(yù)后細(xì)菌數(shù)急劇下降，但是直到觀察結(jié)束仍有部分細(xì)菌存活；陰性組細(xì)菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢生長(zhǎng)趨勢(shì)。具體見(jiàn)圖1。

圖1 肺炎克雷伯菌生長(zhǎng)曲線

4 討論

我國(guó)既是抗生素生產(chǎn)大國(guó)，也是抗生素使用大國(guó)。相關(guān)資料顯示，我國(guó)年產(chǎn)抗生素原料大約2.1×108kg，其中3×107kg用于出口，剩余近1.8×108kg完全由國(guó)內(nèi)市場(chǎng)消化(包括醫(yī)療與農(nóng)業(yè)使用)，人均年消費(fèi)量達(dá)到驚人的138g(美國(guó)僅13g)。由于人類濫用抗生素，現(xiàn)在一代耐藥菌的產(chǎn)生只要2年時(shí)間，而醫(yī)藥工作者開(kāi)發(fā)一種新的抗生素大約需要10年時(shí)間，抗生素的研制速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上耐藥菌的產(chǎn)生速度。耐藥菌感染給臨床工作帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)[7-8]。《Cell》[6]雜志曾報(bào)道：受到感染的機(jī)體組織中細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性不盡相同，部分生長(zhǎng)緩慢的致病菌表現(xiàn)出明顯的耐藥性，“休眠”并非是細(xì)菌耐藥的唯一原因，緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌耐藥性雖然稍低于“休眠”細(xì)菌，但由于其數(shù)量龐大，是造成抗生素失效以及感染復(fù)發(fā)的主要原因。于是針對(duì)上述情況我們做一假設(shè)：如果某種干預(yù)措施能夠促進(jìn)耐藥菌的生長(zhǎng)，是否可以作為已經(jīng)被耐藥的抗生素繼續(xù)發(fā)揮滅菌作用的前提？本研究使用的KP是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的代表菌種，在用空白組培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢的跡象，這與Basel大學(xué)的科學(xué)家們的發(fā)現(xiàn)具有一致性，驗(yàn)證了“休眠”及生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌均是細(xì)菌耐藥性的原因。故我們認(rèn)為一定程度上加快耐藥性細(xì)菌的生長(zhǎng)速度可能是協(xié)助抗生素殺菌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

中草藥在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)預(yù)防及治療細(xì)菌感染方面的作用日益受到重視，中藥制劑中具有抗菌作用的復(fù)方或單方制劑以及中西藥配伍制劑正不斷得到研究與證實(shí)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)屢有報(bào)道用麻黃附子細(xì)辛湯治療久不見(jiàn)癒的慢性肺炎、肺梗阻等疾病；諸多國(guó)內(nèi)外報(bào)道[9-12]中患者均已經(jīng)使用或單獨(dú)使用抗生素進(jìn)行抗感染治療，但療效不佳，再使用或配合使用麻黃附子細(xì)辛湯治療后取得較好療效。對(duì)于麻黃附子細(xì)辛湯實(shí)驗(yàn)室的抗菌譜目前研究尚少，于是我們?cè)O(shè)想：麻黃附子細(xì)辛湯發(fā)揮抗感染的作用是否與促進(jìn)耐藥菌株的生長(zhǎng)有關(guān)。

根據(jù)這一設(shè)想，本研究采用產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的代表菌種KP，KP產(chǎn)生耐藥性是自身產(chǎn)生滅活酶、外膜孔蛋白的變化、生物膜的產(chǎn)生以及細(xì)菌主動(dòng)外排結(jié)構(gòu)的改變等多種因素共同作用的結(jié)果[13]。KP對(duì)頭孢唑林的耐藥率較高，有研究表明，KP對(duì)頭孢唑林的耐藥率達(dá)33.5%，故本實(shí)驗(yàn)選用頭孢唑林為聯(lián)用抗生素。替加環(huán)素是新一代治療革蘭氏陰性菌的有效藥 ，文獻(xiàn)報(bào)道，新一代甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物替加環(huán)素對(duì)克雷伯菌具有極高的敏感性[14]，故本實(shí)驗(yàn)選用替加環(huán)素作為陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)對(duì)不同組別藥物接種KP并進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)頭孢唑林組細(xì)菌自藥物干預(yù)后活菌數(shù)逐漸減少，但在培養(yǎng)60h后細(xì)菌減少的趨勢(shì)停止；另一組替加環(huán)素藥物干預(yù)后細(xì)菌數(shù)急劇下降，但是直到觀察結(jié)束仍有部分細(xì)菌存活，這說(shuō)明余下的細(xì)菌耐受了抗生素，導(dǎo)致抗生素不發(fā)揮作用；在對(duì)中藥復(fù)方組的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)12h時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌逐漸生長(zhǎng)，直至培養(yǎng)120h后細(xì)菌濃度才逐漸下降，直至培養(yǎng)180h時(shí)細(xì)菌濃度保持不變，這一現(xiàn)象說(shuō)明中藥在干預(yù)初期引起了耐藥菌株的生長(zhǎng)，說(shuō)明部分原先處于“休眠”或者生長(zhǎng)緩慢的菌株被激活；在中藥復(fù)方聯(lián)合抗生素組我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)12h時(shí)細(xì)菌數(shù)逐漸減少，并在培養(yǎng)144h時(shí)各組基本無(wú)細(xì)菌生存跡象，我們推測(cè)：聯(lián)合用藥時(shí)使原先部分因?yàn)椤靶菝摺被蛘呱L(zhǎng)緩慢逃過(guò)抗生素扼殺的細(xì)菌重新激活，隨之再將它們滅殺。

總之，麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合抗生素對(duì)臨床耐藥病菌表現(xiàn)出較為理想的協(xié)同抗菌活性，可能是中藥激活細(xì)菌生長(zhǎng)后為抗生素的滅菌提供了更為有利的環(huán)境，然而中藥是通過(guò)何種途徑激活“休眠”或者生長(zhǎng)緩慢的耐藥菌，本階段尚未進(jìn)行研究，將作為下階段的主要課題。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2014-12-20

四川省中醫(yī)藥管理局課題(2012-E-042)

楊露(1975-)，女 ，碩士，成都中醫(yī)藥大學(xué)圖書館實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。

R285.5

A

1673-2197(2015)09-0018-03

10.11954/ytctyy.201509008