固相萃取-高效液相色譜法測定廢水中的酚類化合物

劉 彬，李愛民，賀小敏，2，陳瑞文，張 強

1．湖北省環境監測中心站，湖北 武漢 430072

2．華中農業大學食品科技學院，湖北 武漢 430070

3．湖北省環境科學研究院，湖北 武漢 430072

4．浠水縣環境保護局，湖北 浠水 438200

酚類化合物是一類重要的有毒有害物質，它既有親水性基團，又有疏水性基團，其中疏水性基團會與生物體細胞的某些結構片段結合，導致細胞的組織結構發生改變，于是親電的代謝產物就能結合在生物體細胞上，嚴重損害DNA和酶［1-2］。美國環保署早在20世紀70年代就將11種酚類化合物列入129種環境優先污染物之中［3-4］，中國也于20世紀90年代提出了符合國情的68種水中優先控制污染物，其中6種是酚類化合物［5］。環境中的酚類化合物主要來自于制藥、印染、造紙、農藥等工農業生產過程的廢水排放［6］，因此對相關行業廢水中酚類化合物的測定具有非常重要的意義。

目前對水樣中酚類化合物的測定主要是基于色譜技術建立的，包括氣相色譜法［7］、氣相色譜-質譜法［8］、高效液相色譜法［9］等。以氣相色譜為基礎的分析方法往往需要對目標化合物進行衍生來產生檢測信號，避免峰拖尾和變寬或是增加其揮發性，在這個過程中常常會造成目標化合物的損失和污染，相比之下，高效液相色譜法就顯得更為方便恰當。然而用高效液相色譜法對環境水樣(特別是廢水樣品)中酚類化合物進行分析時，又會經常遇到基質復雜、目標化合物濃度低等不利因素，因此合適的樣品前處理手段必不可少。其中液-液萃取法(LLE)是最為常見的經典方法［10-11］，缺點是有機溶劑使用量大、耗時較長、對較臟水樣凈化效果差，于是漸漸被固相萃取法(SPE)所取代［12］。固相萃取法的基本原理是先將大體積水樣連續通過充有填料的固相萃取柱，目標化合物和部分雜質會同時被吸附在填料上，此后再用小體積的洗脫劑將目標化合物選擇性淋洗下來，可同時起到凈化和濃縮的效果，并且有機溶劑用量小［13-16］。廢水中酚類化合物的固相萃取方法中，最普遍的是 GDX-502樹脂層析柱法［17］，該法需要手動填充，且操作較為繁瑣。本文建立了商業化Supelclean ENVI-Chrom P小柱固相萃取與高效液相色譜聯用的分析方法，測定某造紙廠廢水樣品中的酚類化合物，操作簡單、凈化效果好且具有較高的精密度和準確度。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司);Eclipse XDB-C18(5 μm×4.6 mm×150 mm)色譜柱;Acclaim 120 C18(5 μm ×4.6 mm ×250 mm)色譜柱;VisiprepTMDL 12孔固相萃取裝置(配有真空泵和虹吸管，美國);SupelcleanTMENVITMChrom P小柱(3 mL/250 mg，美國);帶5 mL準確刻度的玻璃離心管;100 mL玻璃燒杯;精密 pH試紙(pH為0.5～5);0.22 μm濾膜;棕色進樣小瓶(2 mL，德國)。

甲醇中11種酚類化合物混合標準溶液，濃度為0.5 mg/mL(美國Accustandard標準品M-604，包括苯酚、對硝基酚、鄰氯酚、2，4-二硝基酚、鄰硝基酚、2，4-二甲酚、4-氯間甲酚、2，4-二氯酚、4，6-二硝基鄰甲酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚，保質期到2021年11月4日。);乙酸、丙酮、乙腈、甲醇均為色譜純(美國Tedia公司);鹽酸(分析純);碳酸氫鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);實驗用純水均為屈臣氏蒸餾水(經空白試驗檢驗，確認在目標化合物的保留時間區間內沒有干擾色譜峰出現或其中的目標化合物濃度低于方法檢出限);試劑水:1%(體積)乙酸水溶液。

1.2 樣品前處理

小柱活化:將Supelclean ENVI-Chrom P小柱組裝于固相萃取裝置上，依次用3 mL乙腈、3 mL純水進行淋洗(1.5 mL/min)，最后保持適當的液面防止柱子干裂。

富集淋洗:量取50 mL廢水樣品于100 mL玻璃燒杯中(可根據樣品中目標化合物的濃度適當增加或減少取樣量)，用6 mol/L鹽酸調節pH小于2(保證其分子形態和穩定性)，以3 mL/min速度加至活化好的小柱中，然后滴加5 mL、0.05 mol/L的NaHCO3溶液來除去多余的有機酸并將小柱抽干。

洗脫過程:用4 mL乙腈以3 mL/min的流速進行洗脫，下接帶5 mL準確刻度的玻璃離心管，洗脫完畢后用乙腈準確定容至5 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，待分析測定。

1.3 儀器分析

Eclipse XDB-C18色譜柱梯度洗脫條件:初始乙腈-試劑水(乙腈40%)，保持6 min，20 min時升至 90%乙腈、25 min時乙腈-試劑水(乙腈40%)，然后運行1 min。Acclaim 120 C18色譜柱梯度洗脫條件:初始乙腈-試劑水(乙腈30%)，保持6 min，35 min時升至90%乙腈、40 min時乙腈-試劑水(乙腈30%)，然后運行1 min。

流速為1 mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20 μL，DAD 檢測波長為270、280、290、305 nm。

1.4 質量控制

采用全程空白、平行分析、加標回收實驗對分析過程進行質量控制。全程空白即以純水為空白樣品，與廢水樣品一起完成全部分析流程，用以考察實驗過程的沾污情況;平行分析即制備6份相同的水樣，分別完成全部分析流程，用以考察分析方法的精密度;加標回收實驗即在樣品處理前加入一定量的11種酚混合標準溶液，與本底樣品同時完成全部分析流程，測定其回收率，用以考察分析方法的準確度。用該方法的系列標準方程測定相關有證標準樣品溶液，所得結果都在誤差允許的范圍內。

2 結果與討論

2.1 干擾與消除

廢水樣品可能存在懸浮物較多的情況，在固相萃取之前需先用玻璃纖維濾膜進行過濾;若水樣中含油量較高也會影響分析過程，可預先用正己烷或者環己烷進行液-液萃取去除干擾;對于含有殘留氯的水樣，需要在分析前加入硫代硫酸鈉加以去除。

儀器分析時，當測定高濃度樣品后可能會存在記憶效應，可通過分析空白樣品，直到空白樣品中目標化合物的濃度低于測定下限時，方可分析下一樣品。

2.2 固相萃取條件的選擇

廢水樣品基質十分復雜，除了酚類化合物以外，還含有大量在紫外光區有吸收的干擾物質［18］，這些物質可能會與酚類化合物出峰時間相同，干擾測定。可根據酚類化合物的特性(如在酸性條件下以中性分子形態存在、疏水性強、在反相柱上有保留等［19］)，建立合適的固相萃取方法來實現廢水樣品中酚類化合物與其他物質的有效分離。

目前針對廢水中酚類化合物，最常見的固相萃取填料是GDX-502樹脂，它是一種苯乙烯型大孔吸附樹脂，既有較大的比表面和適當的孔徑結構，又因含有極性基團氰基(－CN)而具有中強極性，有利于通過分子間作用力和較氫鍵弱的作用力從水中富集弱極性的酚類化合物［20］。然而基于GDX-502樹脂所建立的層析柱法需要經過丙酮浸泡、乙腈回流、手動填充等繁瑣操作［17］，不僅耗時，而且會大量使用有機溶劑。本方法選用的商業化Supelclean ENVI-Chrom P小柱填料是苯乙烯二乙烯基苯聚合物，其比表面較大孔型吸附劑更大，對酚類化合物的吸附能力也更強，更重要的是，商業化小柱避免了填料的預處理和手動填充等操作，大大節省了時間、人力。

樣品溶液經Supelclean ENVI-Chrom P小柱富集后，需要用0.05 mol/L NaHCO3溶液去除多余的有機酸以防其影響后續的洗脫過程。此時由于pH升高，大多數酚類化合物的形態會發生改變，進而引起顏色上的變化(無色變為淡黃色)，因此用乙腈進行淋洗時，可根據有色物質的移動狀態來判斷洗脫劑對目標化合物的洗脫進度。實驗過程中發現，當乙腈的用量為3 mL時，有色物質可完全被淋洗至玻璃離心管中。測定比較了乙腈用量分別為3、4、5 mL時11種酚類化合物的空白加標回收率，結果差別不大，于是在后期實驗中選用4 mL乙腈對目標物化合物進行淋洗。

2.3 液相色譜條件的選擇

乙腈與甲醇相比，具有紫外吸收小、產生鬼峰少、產生柱壓小等優勢，所以選用乙腈和純水作為流動相對目標化合物進行梯度洗脫。另外，純水中含有1%的乙酸是為了保持弱酸性，防止酚類化合物成鹽。分別用Eclipse XDB-C18色譜柱、Acclaim 120 C18色譜柱對11種酚類化合物進行分析。按照第“1.3”小節所述的梯度洗脫條件，可實現標準混合溶液中酚類化合物的較好分離(圖1)，且能得到尖銳的色譜峰。

圖1 4個波長下的11種酚類化合物混合標準溶液色譜圖(Acclaim 120 C18色譜柱)

不同化合物的最大紫外吸收波長不同。二極管陣列檢測器(DAD)與普通紫外檢測器相比，具有可以同時對樣品在不同波長下吸收值進行全掃描的優勢。通過DAD掃描和相關文獻調研［20-21］確定11種酚類化合物的最大吸收波長如下:苯酚、4，6-二硝基鄰甲酚為 270 nm，鄰氯酚、2，4-二硝基酚、鄰硝基酚、2，4-二甲酚、4-氯間甲酚為280 nm，2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚為 290 nm，對硝基酚、五氯酚為305 nm。

2.4 標準曲線系列及方法檢出限

配制系列濃度為 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10 mg/L 的 11 種酚類化合物混合標準溶液，直接進高效液相色譜檢測。以質量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)分別繪制了11種酚類化合物的標準曲線，在濃度點較為密集的情況下，大多數化合物的線性回歸方程相關系數也都在0.999以上(表1)。

在50 mL空白水樣中加入低濃度酚類化合物(加標量均為0.25 μg)，按照樣品分析步驟平行測定7份，根據3倍標準偏差計算11種酚類化合物的方法檢出限，結果見表1。11種酚類化合物的方法檢出限為 2×10－3～2×10－2mg/L，低于《污水綜合排放標準》(GB 8978—2002)的限值，能夠滿足檢測要求。

表1 11種酚類化合物標準曲線系列和方法檢出限

2.5 方法精密度、準確度

制備6份相同的水樣(加標量均為25 μg)，分別完成全部分析過程，所得結果的相對標準偏差(RSD)為2.7% ～16.4%，表明該方法具有良好的精密度。

11種酚類化合物6次平行分析結果見表2。

表2 11種酚類化合物6次平行分析結果 mg/L

對水樣進行加標回收實驗來考察方法的準確度。由表3可知，對空白樣品進行3個濃度水平的加標，回收率為92.3% ～113.8%;對兩份基質較為復雜的廢水樣品加標，除2，4-二硝基酚的回收率偏低以外，其他酚類化合物的回收率為61.4% ～115.8%之間。

表3 11種酚類化合物的加標回收率結果 %

2.6 實際樣品分析

采集某造紙廠的兩種廢水樣品A、B，均為不透明的深色均相樣品，用Supelclean ENVI-Chrom P小柱對其進行固相萃取，平行兩份，處理后的樣品溶液透明度大大提升，且儀器分析時雜質峰較少，可見該方法凈化效果優良。兩種廢水樣品均有部分酚類化合物被檢出(表4)，但是沒有超過《污水綜合排放標準》(GB 8978—2002)所規定的三級標準限值。與《水和廢水監測分析方法》(第四版)所述的GDX-502樹脂層析柱法測定結果較為一致。

表4 11種酚類化合物的實際樣品分析結果 mg/L

3 結論

Supelclean ENVI-Chrom P柱固相萃取-高效液相色譜法通過固相萃取過程對廢水樣品中的目標化合物進行提取和富集，并通過設定合適的儀器分析條件實現了11種酚類化合物的有效分離，與傳統分析方法相比，具有操作簡單、耗時短、有機溶劑用量少的優點。采用該方法對廢水樣品中的11種酚類化合物進行測定，方法檢出限為2×10－3～2 ×10－2mg/L，且具有良好的精密度和準確度，能夠滿足《污水綜合排放標準》(GB 8978—2002)的分析要求。

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