UPLC－MS／MS法測定3種中獸藥制劑中非法添加的阿莫西林和氨芐西林

喬 穎，劉雪紅，董弘揚(yáng)，侯 穎，王 馳，李 娟，張藝多

（1.大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連116037；2.大連市沙河口區(qū)食品藥品監(jiān)督所，遼寧大連116021）

UPLC－MS／MS法測定3種中獸藥制劑中非法添加的阿莫西林和氨芐西林

喬 穎1，劉雪紅1，董弘揚(yáng)2，侯 穎1，王 馳1，李 娟1，張藝多1

（1.大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連116037；2.大連市沙河口區(qū)食品藥品監(jiān)督所，遼寧大連116021）

應(yīng)用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了3種中獸藥制劑中非法添加阿莫西林和氨芐西林的檢測方法。樣品經(jīng)50%乙腈水溶液提取、稀釋后進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)采用0.2%甲酸乙腈溶液與0.2%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)Atlantis T3柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）分離，通過多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行測定。結(jié)果表明，阿莫西林和氨芐西林在1～50 ng／mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測限分別為0.5 mg／g和0.2 mg／g。阿莫西林回收率在83.4%～95.8%之間，RSD為2.0%～4.6%；氨芐西林回收率在85.1%～97.2%，RSD為1.7%～4.0%。本方法準(zhǔn)確、可靠，可用于中獸藥制劑中非法添加阿莫西林和氨芐西林的檢測。

中獸藥制劑；阿莫西林；氨芐西林；超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法

阿莫西林與氨芐西林，均屬于β－內(nèi)酰胺類抗生素。主要用于革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性菌感染，如巴氏桿菌病、大腸桿菌病、白痢、沙門氏菌病、葡萄球菌、鏈球菌感染；腸道感染、腸毒綜合癥輔助治療等［1］。因其良好的治療作用，被非法添加到一些中獸藥制劑中，以增強(qiáng)中獸藥制劑的治療效果，但是，這種非法添加會(huì)導(dǎo)致在畜禽疾病治療過程中，對(duì)阿莫西林和氨芐西林的使用對(duì)象和使用劑量失去有效控制，誘使畜禽耐藥菌的產(chǎn)生，造成畜產(chǎn)品藥物殘留等問題，進(jìn)而再通過食物鏈的傳遞過程，給人類健康帶來嚴(yán)重危害，如過敏反應(yīng)、增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性等［2］。目前，尚沒有針對(duì)中獸藥制劑中非法添加阿莫西林和氨芐西林檢測方法研究的報(bào)道，本研究建立了3種中獸藥制劑非法添加阿莫西林和氨芐西林的UPLC－MS／MS測定方法。

1 材料

1.1 儀器設(shè)備 XEVO TQ－S ACQUITY超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源，美國Waters公司；電子天平RD－200，德國Sartorius公司；超聲波清洗機(jī)；離心機(jī)RJ－TDL－40B；渦旋振蕩器。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 對(duì)照品 阿莫西林，批號(hào)K0221206，含量86.4%，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；氨芐西林，批號(hào)130410－201207，含量86.5%，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2.2 供試品 白頭翁散：江西快康動(dòng)物保健品有限公司，批號(hào)20140503；止痢散：鄭州金大眾動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)20131303；烏梅散：廣西大銀田獸藥有限公司，批號(hào)130601。以上3種中獸藥制劑經(jīng)檢測均不含阿莫西林和氨芐西林。

1.2.3 試劑 乙腈色譜純、乙腈分析純、甲酸色譜純、水為符合GB／T 6682－1992規(guī)定的一級(jí)水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Atlantis T3 2.1 mm×150 mm， 5 μm；流動(dòng)相 A：0.2%甲酸乙腈溶液；流動(dòng)相 B：0.2%甲酸水溶液；流速0.3 mL／min；柱溫30℃；進(jìn)樣量5 μL，液相色譜梯度洗脫程序見表1。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；正離子掃描（ESI＋）；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度150℃；脫溶劑氣流速650 L／h；脫溶劑氣溫度350℃；毛細(xì)管電壓3 kV。定性、定量離子對(duì)和對(duì)應(yīng)的錐孔電壓及碰撞能量見表2。

表1 梯度洗脫程序表

表2 定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞能量表

2.3 樣品制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制 精密稱取阿莫西林和氨芐西林對(duì)照品適量，分別置于25 mL量瓶中，加50%乙腈水溶液溶解，并定容至刻度，混勻，配制得到1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液的配制 精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用初始比例流動(dòng)相稀釋，制成濃度分別為1、2、5、10、20、50 ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照樣品 取經(jīng)檢測不含阿莫西林和氨芐西林的白頭翁散、止痢散、烏梅散各1 g，作為陰性對(duì)照樣品。

2.3.4 陽性添加樣品的制備 分別精密稱取5、10、20 mg阿莫西林和氨芐西林對(duì)照品，加入到3種陰性對(duì)照樣品中，配制成5、10、20 mg／g的陽性添加樣品。

2.4 樣品處理 精密稱取中獸藥制劑1 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入 50%乙腈水溶液100 mL，超聲提取10 min；4000 r／min離心5 min；精密移取上清液，用初始比例流動(dòng)相稀釋10000倍后，過0.22 μm濾膜后供測定用。

2.5 結(jié)果

2.5.1 專屬性 取3種中獸藥制劑的陰性對(duì)照樣品溶液以及陽性添加樣品溶液，按既定檢測方法進(jìn)行分析，其定量離子MRM色譜圖分別見圖1、圖2、圖3。結(jié)果表明，在此條件下，在阿莫西林和氨芐西林的出峰處無干擾。

圖1 白頭翁散陽性添加阿莫西林和氨芐西林樣品（5 mg／g）及陰性對(duì)照樣品定量離子MRM色譜圖

圖2 止痢散陽性添加阿莫西林和氨芐西林樣品（5 mg／g）及陰性對(duì)照樣品定量離子MRM色譜圖

圖3 烏梅散陽性添加阿莫西林和氨芐西林樣品（5 mg／g）及陰性對(duì)照樣品定量離子MRM色譜圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取2.3.2項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液，濃度由低到高依次分析，以定量離子色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（ng／mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在1～50 ng／mL的濃度范圍內(nèi)，阿莫西林的回歸方程為y＝163.23＋796.52x，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9998；氨芐西林的回歸方程為y＝1412.8＋4838.4x，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9999。從回歸方程及相關(guān)系數(shù)可以看出，阿莫西林和氨芐西林在1～50 ng／mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

2.5.3 最低檢測限 分別取各陽性添加樣品，按2.4項(xiàng)的方法進(jìn)行處理，用初始比例流動(dòng)相進(jìn)行逐級(jí)稀釋，以信噪比的3倍為最低檢出限，測得阿莫西林在3種中獸藥制劑中的最低檢出濃度為0.5 ng／mL，最低檢測限為0.5 mg／g；氨芐西林在3種中獸藥復(fù)方制劑中的最低檢出濃度為0.2 ng／mL，最低檢測限為0.2 mg／g。

2.5.4 精密度 取5 ng／mL含阿莫西林和氨芐西林的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按既定的液相條件和質(zhì)譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，阿莫西林的RSD為1.1%，氨芐西林的RSD為1.4%。結(jié)果表明，該方法的精密度良好。

2.5.5 準(zhǔn)確度 分別取不同添加濃度的各陽性添加樣品，每個(gè)樣品6份，按2.4項(xiàng)的方法進(jìn)行處理，經(jīng)測定，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見表3、表4。從表中試驗(yàn)結(jié)果可以看出，阿莫西林在3種中獸藥制劑的平均回收率在83.4%～95.8%，RSD在2.0%～4.6%；氨芐西林在3種中獸藥制劑的平均回收率在85.1%～97.2%，RSD在1.7%～4.0%，表明該方法回收率較好，準(zhǔn)確度高。

表3 3種中獸藥制劑中添加阿莫西林回收率試驗(yàn)結(jié)果表 （n＝6）

表4 3種中獸藥制劑中添加氨芐西林回收率試驗(yàn)結(jié)果表 （n＝6）

2.5.6 穩(wěn)定性 取上述2.5.5項(xiàng)下制備的供試液（添加濃度5 mg／g，n＝6），分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果見表5。從表中結(jié)果可以看出，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表 （以峰面積平均值計(jì)，n＝6）

3 討論與小結(jié)

3.1 中獸藥制劑種類的選擇 白頭翁散具有清熱解毒，涼血止痢之功效，用于治療大腸桿菌等引起的毒性膿痢等；止痢散具有止痢化濕之功效，用于腹瀉、止痢、大腸桿菌病等；烏梅散具有清熱解毒，澀腸止瀉之功效，用于幼畜禽的止瀉［3］。而阿莫西林和氨芐西林對(duì)革蘭氏陰性桿菌，如大腸桿菌、巴氏桿菌等有較好的抗菌作用，常用于治療大腸桿菌病、痢疾等。由于其抗菌效果好、價(jià)格低廉，在畜禽養(yǎng)殖中極有可能被非法添加到以上具有類似功能主治的中獸藥制劑中，故選擇以上3種中獸藥制劑作為代表來建立阿莫西林和氨芐西林非法添加的測定方法。

3.2 陽性添加濃度的選擇 根據(jù)阿莫西林、氨芐西林以及3種中獸藥制劑在畜禽疾病治療過程中的使用量，將阿莫西林和氨芐西林的治療量折算到3種中獸藥制劑的使用量中來計(jì)算其在中獸藥制劑的陽性添加濃度，最終選擇阿莫西林和氨芐西林的陽性添加濃度均為5、10、20 mg／g。

3.3 檢測方法的選擇 阿莫西林和氨芐西林，均屬于β－內(nèi)酰胺類抗生素，常用的檢測方法包括微生物法、免疫分析法、高效液相色譜法以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中微生物法，過程復(fù)雜，干擾較多，特異性低［4］；免疫分析法專屬性差，假陽率高［5－6］；而高效液相色譜法，需要進(jìn)行衍生化，操作繁瑣［7－8］。本文采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，分析時(shí)間短，適用于對(duì)中獸藥制劑中非法添加的快速、準(zhǔn)確定性定量檢測。

3.4 樣品處理方法的選擇 中獸藥制劑與肌肉、肝、血液等樣品相比，無蛋白及脂肪的干擾，無需過固相萃取柱凈化［9－10］，且中獸藥制劑添加量較大，無需濃縮。經(jīng)過對(duì)2種β－內(nèi)酰胺類藥物的反復(fù)試驗(yàn)，50%乙腈水溶液對(duì)藥物有很好的溶解性，因此樣品的提取溶劑選用50%乙腈水溶液。樣品經(jīng)過超聲提取，提取效率高，同時(shí)考察超聲時(shí)間，發(fā)現(xiàn)超聲10 min時(shí)，已足以將非法添加藥物提取完全。

本文建立的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法，可用于檢測中獸藥制劑白頭翁散、止痢散、烏梅散中非法添加的阿莫西林和氨芐西林。該方法樣品前處理簡便快速、檢測時(shí)間短，靈敏度高，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確、可靠。

［1］中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二○一○年版（一部） ［S］.

［2］馬昊楠.抗生素殘留與人體健康—禽類養(yǎng)殖中抗生素的濫用［J］.首都醫(yī)藥，2014，23：23－24.

［3］中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典二○一○年版（二部） ［S］.

［4］吳 遐，紹 輝，王 鑫，等.試管擴(kuò)散法檢測牛乳中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，42（5）：31－35.

［5］姜 侃，陳宇鵬，金燕飛，等.應(yīng)用酶聯(lián)免疫法快速檢測乳品中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留［J］.中國乳品工業(yè)，2010，38（1）：51－54.

［6］張 佳.放射受體分析法快速篩檢動(dòng)物組織中β－內(nèi)酰胺類獸藥殘留［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2007.

［7］孫艷俠.高效液相色譜在乳品抗生素殘留檢測中的應(yīng)用［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（3）：10－13.

［8］謝愷舟，陳學(xué)森，徐 東，等.高效液相色譜熒光檢測法檢測雞蛋中阿莫西林殘留［J］.食品科學(xué)，2012，33（22）：264－268.

［9］孫 雷，張 儷，汪 霞，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)動(dòng)物源性食品中13種β－內(nèi)酰胺類藥物殘留的檢測［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2009，28（5）：576－580.

［10］劉洪斌，文 一，劉勇軍，等.LC－MS／MS法檢測牛奶中14種β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留［J］.分析試驗(yàn)室，2014，33（2）：221－224.

（編 輯：侯向輝）

Detection of Illegally Added Amoxicillin and Ampicillin in 3 Kinds of Traditional Chinese Medicine for Animals by UPLC－MS／MS

QIAO Ying1，LIU Xue－h(huán)ong1，DONG Hong－yang2，HOU Ying1，WANG Chi1，LI Juan1，ZHANG Yi－duo1
（1.Dalian Institute Veterinary Drug and Feedstuffs Control，Dalian，Liaoning116037，China；2.Dalian Shahekou District Food and Drug Inspection Institute，Dalian，Liaoning116021，China）

A method based on ultra－performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC－MS／MS）was developed for the determination of amoxicillin and ampicillin illegally added in 3 kinds of traditional Chinese medicine for animals.Samples were extracted by 50%acetonitrile solution and diluted.The analyte was separated by Atlantis T3 column with a linear gradient elution program of 0.2%formic acid acetonitrile and 0.2% formic acid aqueous solution.Multiple reaction monitoring was used for the selective detection.The results demonstrated that the linearity range of amoxicillin and ampicillin were 1～50 ng／mL，and the limit of detection was 0.5 mg／g and 0.2 mg／g，respectively.The recovery was 83.4%～95.8%withRSDof 2.0%～4.6%for amoxicillin，and the recovery was 85.1%～97.2%withRSDof 1.7%～4.0%for ampicillin.It indicated that the method was accurate and reliable for determination of amoxicillin and ampicillin illegally added in 3 kinds of traditional Chinese medicine for animals.

traditional Chinese medicine for animals；amoxicillin；ampicillin；UPLC－MS／MS

2015－01－19

A

1002－1280（2015）04－0030－05

S859.83

喬 穎，碩士研究生，從事獸藥及獸藥殘留檢測工作。E－mail：qiaoyingwd＠163.com