人腦星形細(xì)胞瘤中HIF－I a和COX－2的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系①

姜 壯，劉勁睿，許高權(quán)

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

星形細(xì)胞瘤是神經(jīng)外科常見的疾病，為浸潤性生長腫瘤，多數(shù)腫瘤手術(shù)難以切除完全，且復(fù)發(fā)后腫瘤可演變成更高級別星形細(xì)胞瘤，預(yù)后較差。人們通過研究腫瘤分子生物學(xué)，逐漸認(rèn)識到腫瘤的發(fā)生受多種因素影響，起到關(guān)鍵性作用的是腫瘤基因的激活和抑腫瘤基因的失活，并且有多種細(xì)胞因子參與。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia－inducible factor－1，HIF－1)是Semenza等人在1994年發(fā)現(xiàn)的［2］，對缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)有重要影響［1］，是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進(jìn)腫瘤血管的生長。環(huán)氧化酶－2(cyclooxygenase，COX－2)是生成前列腺素以及分解花生四烯酸的一種非常重要的限速酶，通過大量的研究，得知該限速酶可以有效推動腫瘤新生血管的形成和發(fā)展［4，5］。

1971年，在腫瘤界，提出了如下假設(shè):以腫瘤血管形成為出發(fā)點(diǎn)，把腫瘤的形成和發(fā)展劃分成為如下兩個生長環(huán)節(jié):一是血管生長環(huán)節(jié);二是血管生長前期。在人的身體中，都是依靠血管來為全身組織提供營養(yǎng)，腫瘤的形成和發(fā)展也是如此［3］。如果血管不能夠提供足夠的營養(yǎng)，那么腫瘤就難以發(fā)生轉(zhuǎn)移和生長?，F(xiàn)階段，對腫瘤血管進(jìn)行有效抑制也成為治療腫瘤的一種新途徑。

本實(shí)驗(yàn)對人腦星形細(xì)胞瘤和正常腦組織表達(dá)檢測，從分子水平來探討星形細(xì)胞瘤和正常腦組織病理學(xué)分級的關(guān)系。本研究旨在明確星形細(xì)胞瘤中HIF－1α、COX－2表達(dá)變化以及它們與腫瘤微血管密度和臨床病理特征的關(guān)系，分析了HIF－1α、COX－2在星形細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展的作用及它們的相互作用。為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

將佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科和佳木斯市中心醫(yī)院神經(jīng)外科2012－02～2013－10手術(shù)切除標(biāo)本51例為研究對象，其中16例顳頂葉及以顳頂葉為主，16例發(fā)生于額葉及以額葉為主，19例發(fā)生于其它部位。女31例，男20例，年齡7～67歲，病例均為原發(fā)病例，術(shù)前未行化療和放療。

1.2 方法

用福爾馬林液固定一部分標(biāo)本，制成蠟塊，切成厚約4μm的連續(xù)切片3張做免疫組化染色。另一部分標(biāo)本存放液氮罐內(nèi)，在溫度為的冰箱里保存。依據(jù)目前所執(zhí)行的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，對標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)分級，處于Ⅰ級的有11例，Ⅱ級21例，Ⅲ級12例，Ⅳ級7例。低度惡性實(shí)驗(yàn)組為Ⅰ～Ⅱ級共32例，高度惡性實(shí)驗(yàn)組為Ⅲ～Ⅳ級共19例，對照組選擇21例非瘤腦組織。非瘤腦組織標(biāo)本取自腦外傷病人，處理方法同腫瘤標(biāo)本一致。

1.3 試劑

1:30濃縮型鼠抗人HIF－1單克隆抗體，兔抗人COX－2單克隆抗體(即用型)。鼠抗人CD34單克隆抗體(即用型)。DAB試劑盒(三管裝)。兔二步法檢測試劑盒。鼠二步法檢測試劑盒。

1.4 結(jié)果判定

HIF－1a和COX－2表達(dá)為陽性的現(xiàn)象一般都是胞核內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒，每張切片在200倍顯微鏡下任意挑選五個視野，記錄視野中胞核內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒的細(xì)胞數(shù)和腫瘤細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)，以總細(xì)胞數(shù)中陽性細(xì)胞數(shù)所占比例作為判別的條件，小于為陰性;處于之間的為弱陽性;處于之間的為中度陽性;為強(qiáng)陽性;全部都被看為陽性表達(dá)。

微血管計數(shù):使用單抗對血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，細(xì)胞膜染色比較深。微血管計數(shù)采用Weidner的方法計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析:計數(shù)資料主要采用χ2檢驗(yàn);計量資料采用t檢驗(yàn)和方差分析。取P＜0.05為假設(shè)檢驗(yàn)有統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 正常腦組織中含有的COX－2和HIF－1α要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于星形細(xì)胞瘤，這就意味著COX－2和HIF－1α在星形細(xì)胞瘤的浸潤發(fā)展具有非常重要的作用。

2.2 對于星形細(xì)胞病理分析而言，COX－2和HIF－1α表達(dá)與其具有正相關(guān)性，如果他們分期越晚，那么意味著其表達(dá)程度越高。

2.3 COX－2和HIF－1α的表達(dá)同 MVD呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，在星形細(xì)胞瘤中可以促進(jìn)血管的形成。

表1 在星形細(xì)胞瘤和非瘤腦組織中COX－2蛋白的表達(dá)

表2 在星形細(xì)胞瘤和非瘤腦組織中HIF－1α蛋白的表達(dá)

表3 MVD星形細(xì)胞瘤與非瘤腦組織中的表達(dá)

表4 HIF－1α.COX－2與MVD之間在星形細(xì)胞瘤中的關(guān)系

表5 HIF－1α與COX－2的表達(dá)在星形細(xì)胞瘤中的關(guān)系(R=0.465，P ＜ 0.05)

3 討論

3.1 星形細(xì)胞瘤是浸潤生長性腫瘤，容易復(fù)發(fā)，預(yù)后不良。傳統(tǒng)的治療是以手術(shù)為主，術(shù)后結(jié)合放化療等綜合治療，即使如此也不能完全避免腫瘤的復(fù)發(fā)，而且復(fù)發(fā)的星形細(xì)胞瘤惡性度常常會升高。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因治療和免疫治療給徹底治愈腦星形細(xì)胞瘤帶來了希望［6］。惡性腫瘤內(nèi)部普遍存在缺氧的現(xiàn)象，缺氧可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中HIF－1α表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化檢測，HIF－1α蛋白在星形細(xì)胞瘤中為54.9%的陽性率，在Ⅲ～Ⅳ級星形細(xì)胞瘤幾乎均表達(dá)(陽性率為84.2%)，高于在Ⅰ～Ⅱ級星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)(Ⅰ級陽性率為27.3%，Ⅱ級陽性率為42.9%)。在非瘤腦組織中HIF－1α蛋白為陰性表達(dá)。表明HIF－1α的表達(dá)程度與星形細(xì)胞瘤的病理分級呈正相關(guān)。機(jī)理可能是星形細(xì)胞瘤病理級別越高，腫瘤生長和侵襲的速度越快，則相應(yīng)的缺氧更加嚴(yán)重。

3.2 星形細(xì)胞瘤組織中 COX－2蛋白表達(dá)占58.8%，在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá)，顯著高于正常腦組織(14.3%)。提示COX－2表達(dá)升高可能與星形細(xì)胞瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。這與杜繼臣教授等學(xué)者對膠質(zhì)瘤進(jìn)行研究的結(jié)果相同［7，8］。在研究中我們還觀察到，COX－2的含量水平與星形細(xì)胞瘤的病理級別有關(guān)。高級別的星形細(xì)胞瘤中COX－2的陽性表達(dá)率為89.5%，而在低級別的星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)率為40.6%。兩者之間有顯著差異性(P＜0.05)，可見星形細(xì)胞瘤組織中COX－2隨病理級別的增加陽性率表達(dá)增加，提示COX－2的表達(dá)水平可能與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。不表達(dá)見于正常腦組織，而弱表達(dá)見于低級別腫瘤組織，說明COX－2隨著星形細(xì)胞瘤級別的升高而逐步遞增。從病理學(xué)角度來講COX－2的過高表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞的過度增殖，并抑制細(xì)胞的分化誘導(dǎo)和凋亡。在具有COX－2表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，COX－2可導(dǎo)致前列腺素產(chǎn)生及誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子等血管新生因子，促使腫瘤的產(chǎn)生和腫瘤血管的新生，從而促進(jìn)腫瘤的增殖和發(fā)展。

3.3 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HIF－1α與COX－2在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)成正相關(guān)，且MVD在HIF－1α與COX－2均為陽性表達(dá)的星形細(xì)胞瘤組織中的值明顯高于在兩者均為陰性或其中任一項(xiàng)為陰性表達(dá)的值，提示在腫瘤血管形成過程中HIF－1α與COX－2之間存在一定的關(guān)聯(lián)。可能存在協(xié)同作用。由于HIF－1α、COX－2之間存在復(fù)雜的相互調(diào)控機(jī)制，因此也沒有辦法分析出兩者中哪一種對腫瘤血管的生成更具作用。因此，設(shè)計能夠?qū)@兩者都其作用的抑制劑比只針對一種有效的抑制劑會更加有用，這是一種更為寬廣的研究思路。

［1］ZpllosA.Mitoehondria D －loop sequences are integrated in the rat nuclear genome［J］.J Mo Bi0 ，1991，211(2):12-23

［2］Semenza GL，Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcripitional activation［J］.Mol Cell Biol，1992，12(12):5447-5454

［3］Folkman J.Angiogenesis［J］.Annu Rev Med，2006，57:1-18

［4］PairedM，Engelhard G.Distinetisforms(COX －landCOX －2)of cyclooxyge－nase:possible physiological and therapeutic implications［J］.Fandom Cline Pharmacology，1996，10(1):I-I7

［5］DuBois RN，Awad J，MorrowJ，et al.Regulation ofeieosanoid produetion and Mitogenesis in rat intestinal epithelial cells by transforming growth faetor－ a and Phothol ester［J］.JCIin.Investig，1994，93(2):493-498

［6］印健，趙三虎.膠質(zhì)瘤中HIF－1a的表達(dá)及其增殖指標(biāo)ki67的關(guān)系［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2006，29(2):11

［7］杜繼臣，吳宇明等腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤VEGF，COX－2基因蛋白表達(dá)及臨床意義中國誤診學(xué)雜志，2003，3(10):1460-1463

［8］廉曉宇，李顯偉，李英夫.攬香烯和VEGF多克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用對C6膠質(zhì)瘤增殖抑制作用的研究［J］，黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009，32(1):17