不同溫度對甜瓜的蔗糖和乳酸通量的影響

王會松，龐廣昌，劉婷婷

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134）

不同溫度對甜瓜的蔗糖和乳酸通量的影響

王會松，龐廣昌*，劉婷婷

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134）

從代謝的角度講，果蔬保鮮實際上是保證其存活的情況下降低它的分解代謝來達到延長貨架期，代謝通量規律的深入研究會更好的實現這一目的。本實驗以甜瓜為材料研究果蔬在貯藏過程中代謝網絡通量規律。將甜瓜放置在10個不同溫度（0、5、8、10、20、30、40、45、50、55℃），得到在不同溫度下甜瓜不同部位糖酵解途徑、TCA循環、蔗糖合成途徑、戊糖磷酸途徑的代謝通量。結果顯示：8℃和50℃時蔗糖有較高的合成通量，乳酸也在8℃時有較高的代謝通量，所以8℃是較好的貯藏溫度。這為從代謝的角度深入研究果實的貯藏，延長果蔬的貯藏壽命提供參考。

甜瓜，蔗糖，乳酸，代謝通量

關于果蔬貯藏保鮮，本質上就是在保證活體的情況下最大限度地降低分解代謝，延長生存期或壽命。目前最普遍有效的方法大致分為兩種，即傳統方法（冷藏保鮮和氣調保鮮）和現代貯藏保鮮方法（減壓貯藏[1]、熱處理[2]和保鮮劑等）。其中溫度的調節應用最廣泛，并且越來越多的研究證明經熱處理后的果實貯藏效果更佳[3-5]。溫度對果蔬貯藏品質影響的研究越來越成熟，但是對于貯藏過程中溫度對呼吸代謝的研究比較少。

糖分構成是影響果實品質的一個重要因子[6]，尤其是蔗糖[7-9]。有研究表明，蔗糖等代謝物在甜瓜不同組織間的代謝分布有明顯差異[10-11]，并且這種差異對甜瓜的營養和感官品質有重大影響[12]。哈密瓜中蔗糖的含量會隨貯藏時間和溫度的升高而不斷減少[11]，在甜瓜的貯藏過程中控制蔗糖分解，降低糖類代謝消耗顯得尤為重要。

在果蔬貯藏過程中，分解代謝產生的NADH+H+的氫質子和電子經遞氫體和呼吸鏈傳遞給氧生成水，并通過氧化磷酸化提供能量。儲藏過程中應減少呼吸消耗，將呼吸代謝控制在既能保證其生存，又能維持在最低水平。呼吸作用發生在線粒體中，當超過其呼吸能力或供氧不足時，NADH+H+只能在乳酸脫氫酶催化下，將氫質子交回丙酮酸生成乳酸。正是因為乳酸和NADH+H+這一偶聯關系，以及乳酸的穿梭作用[13]使它在調節有機體細胞呼吸、氧化磷酸化、氧化還原狀態以及合成與分解代謝中發揮關鍵作用[14-16]。已經有研究表明，乳酸在果蔬的貯藏保鮮中發揮重要作用[17]。關于乳酸和蔗糖的代謝通量分析已經應用到了哈密瓜的貯藏與保鮮中[18]。

本實驗對不同溫度下甜瓜不同部位的蔗糖和乳酸通量的變化情況進行研究，旨在尋找甜瓜在貯藏過程中代謝通量的變化規律，為進一步通過代謝分析，從甜瓜生命活動的本質方面延長貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜瓜 天津甜瓜種植基地采摘后，選取無機械損傷、無病蟲害、大小均勻、成熟度一致的優質甜瓜。

3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；J2-21高速冷凍離心機 美國Beckman公司；HVE-50哈雅瑪高壓滅菌器 日本Hirayama Manufacturing公司；SBA-40C生物傳感器分析儀 山東省科學院生物研究所；Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發光檢測儀 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將甜瓜放于氣調箱（25 cm×43 cm× 19.5 cm）中，氣調比例[19]為5%O2＋2%CO2。所有的樣本氣調條件是一致的。采用微型實驗冷庫控制溫度，根據近些年國內外所研究的典型溫度以及本實驗室所做成果[18]作參照，將溫度設置為0、5、8、10、20、30、40、45、50、55℃，氣調貯藏24 h，僅僅貯藏24 h的目的是甜瓜在處理24 h之后達到了在該溫度下的一種穩定的代謝狀態。較高溫度設置的目的是為了了解熱處理時甜瓜的代謝情況，以期為后期的熱處理提供參考。每個溫度設3個平行，取出后按甜瓜中間部位2 cm厚沿赤道平面切開，從瓜皮向瓜心取樣，將甜瓜分為外果皮、內果皮、外果肉、中果肉、內果肉5個部分，分別對應于圖1[6]的1、2、3、4、5，用液氮迅速冷凍，在冰浴條件下研磨，勻漿后將勻漿液全部轉移入離心管，以10000×g、4℃離心10 min，收集上清液，并于－80℃條件貯藏。

圖1 甜瓜部位分割圖Fig.1 The segmentation map of Cucumis melon

1.2.2 甜瓜乳酸和蔗糖代謝網絡圖的構建 根據代謝網絡的研究方法及代謝網絡的構建原則[20]，本實驗以甜瓜為研究對象，選擇糖酵解、蔗糖合成途徑、戊糖磷酸途徑和TCA循環為主要代謝途徑來構建代謝網絡，將直線反應合并為一個反應，忽略不在研究范圍內的代謝途徑，減少代謝網絡的反應數目，得到以下代謝網絡圖。

圖2 蔗糖乳酸代謝網絡圖Fig.2 Sucrose and lactate metabolic network diagram

表1 代謝反應方程Table 1 Metabolic reaction

1.2.3 葡萄糖、蔗糖、乳酸和NADH濃度的測定 根據所建立的甜瓜代謝通量模型，測定的代謝速率有12個（表1），而由胞內中間代謝產物可以確定的質量平衡方程有8個（表2）。假設胞內中間途徑代謝物處于擬穩態，即這8個途徑代謝物沒有積累，它們的質量平衡方程均為0，這樣就可以得到8個約束向量。此時該系統的自由度F=4。而代謝產物系統中的NADH可通過實驗測得，那么總約束向量變為9。通過實驗測定葡萄糖的變化速率r1、蔗糖變化速率r7、乳酸的變化速率r10，已知速率為4個，此方程可以得到唯一解，進而通過計算方程得到蔗糖和乳酸的通量。

表2 甜瓜的質量平衡方程式Table 2 Metabolic flux model equation

運用SBA-40C型生物傳感器分析儀測定出不同溫度貯藏的哈密瓜不同部位中葡萄糖、蔗糖和乳酸的含量。之后分別對其進行時間微分，以測定出變化速率（單位：mg·mL-1·h-1），用于通量的計算。NADH的測定采用Fluoroskan Ascent FL熒光-化學發光檢測儀，其原理采用酶法進行測定，參考Schaefer等[21-23]的研究，并進行了改進，其反應體系為（0.25 mmol/L HEPES/EDTA緩沖液，100 mmol/L KCl，10 mmol/L MgSO4，3 mmol/L 1，3-BPG，0.5 mmol/L DHAP，0.4 U/mL GAPDH）。

1.3 數據分析

使用Matlab 7.0軟件以及SPSS 17.0 for windows軟件計算。

2 結果與分析

2.1 代謝通量圖

測得不同貯藏溫度（0、5、8、10、20、30、40、45、50、55℃）甜瓜蔗糖、葡萄糖、乳酸變化速率，通過平衡方程，利用Matlab 7.0數據處理軟件得到歸一化后的甜瓜蔗糖和乳酸代謝通量圖見圖3～圖7（圖中數據對應的順序為0、5、8、10、20、30、40、45、50、55℃）。從通量分布圖可以看出相同樣本在不同貯藏溫度下的蔗糖和乳酸代謝通量明顯不同，并且在同一溫度下不同組織的蔗糖和乳酸代謝通量也有較大不同。

在內果肉中，0、8℃和40℃的條件下進入磷酸戊糖合成途徑的通量較少，更多的流向糖酵解和蔗糖合成途徑；其他溫度進入磷酸戊糖途徑的通量相對較多。從丙酮酸節點來看，較低溫度（0℃和5℃）以及較高溫度（55℃）進入TCA循環途徑的通量較多，有氧呼吸較強，環境脅迫導致機體作出響應以適應周圍惡劣的環境。

圖3 甜瓜內果肉蔗糖、乳酸通量圖Fig.3 Sucrose，lactic acid flux in Melon pulp 3

圖4 甜瓜中果肉蔗糖、乳酸通量圖Fig.4 Sucrose，lactic acid flux in Melon pulp 2

在中果肉中，5、8、30℃和50℃進入磷酸戊糖途徑的通量較少，其他溫度進入磷酸戊糖途徑的通量接近葡萄糖通量的一半。就丙酮酸節點而言，10℃情況下進入TCA循環途徑通量較少，這時候無氧呼吸大于有氧呼吸，而在45℃和50℃狀態下有氧呼吸較強，高溫使機體分解代謝增強。

圖5 甜瓜外果肉蔗糖、乳酸通量圖Fig.5 Sucrose，lactic acid flux in Melon pulp 1

在外果肉中，8℃和50℃進入磷酸戊糖途徑的通量較少，進入蔗糖途徑的通量較多；其他的實驗組磷酸戊糖途徑通量隨溫度呈現波動的趨勢。丙酮酸節點，低于45℃的實驗組進入TCA循環的通量與進入乳酸的相差不大，而45～55℃之間進入TCA循環的通量較多，有氧呼吸較強，可能是隨溫度的升高機體的分解代謝隨之增強。

在內果皮中，8、10℃和50℃三個溫度下進入磷酸戊糖途徑的較少，合成其他物質的通量降低，甚至在8℃時進入磷酸戊糖途經的通量是負的；而進入蔗糖合成的通量較多。而丙酮酸節點，0℃下進入TCA循環的通量非常大，有氧呼吸強度很大，在寒冷的環境下，機體通過提高分解代謝以應對環境對自身造成的損傷。

圖6 甜瓜內果皮蔗糖、乳酸通量圖Fig.6 Sucrose，lactic acid flux in Melon endocarp

圖7 甜瓜外果皮蔗糖、乳酸通量圖Fig.7 Sucrose，lactic acid flux in Melon epicarp

在外果皮的通量分布中，進入磷酸戊糖途徑的通量隨溫度呈現波動的趨勢，在0、20、30、50℃和55℃情況下進入磷酸戊糖途經的通量較多；而在8℃時進入磷酸戊糖途經的通量仍為負的，但是相對于內果皮而言較小。就丙酮酸節點來看，大部分丙酮酸生成乙酰輔酶A進入TCA循環，進行有氧呼吸，維持機體正常的能量和物質代謝，生成乳酸的通量相對較少。相對于內果皮，外果皮的有氧呼吸增強；在甜瓜外果皮中有氧呼吸占主要優勢。

圖8 不同溫度下甜瓜五部位蔗糖和乳酸的通量Fig.8 The metabolic flux of sucrose and lactate in five parts of melon fruit under different storage temperatures

2.2 蔗糖的代謝通量

糖分構成是影響果實品質的一個重要因素[24]，尤其是蔗糖。蔗糖是光合作用的主要產物，是韌皮部運送的主要形式，也是果實貯存的主要物質。蔗糖含量是甜瓜果實糖分高低的主要決定因素[25]。此外，它還是細胞代謝的調節因子，可能通過影響基因表達發揮作用[26]。在貯藏中降低糖代謝尤為重要。如圖8顯示，就總體而言甜瓜在8℃和50℃有較高的蔗糖通量，但是以8℃最高，尤其是在果皮部位；在內果皮中，8℃是20℃和45℃的蔗糖通量的2.5倍，在外果皮中，8℃是30℃蔗糖通量的2.7倍；在50℃情況下也出現了較高的蔗糖通量，蔗糖是甜瓜果實含量最多且最為穩定的糖分，在一定的溫度范圍內，根據稀溶液依數性原理，蔗糖含量增加有利于機體抵抗高溫的脅迫；這個溫度可以為果蔬的熱處理溫度值域提供參考。而在不同的部位之間通量來看，甜瓜的蔗糖通量由內到外有先降低后升高的趨勢，而甜瓜中組織的發育和組織代謝物的交流與協調對果實營養品質和感官品質都具有重要的影響。從貯藏溫度來看，顯然8℃大部分的葡萄糖通量流入蔗糖合成途徑，更有利于甜瓜的保藏。

2.3 乳酸代謝通量

乳酸在果蔬的貯藏保鮮中發揮重要作用[27]。乳酸的通量有很重要的意義，它既可以反映呼吸代謝的受限情況，也可以反映合成代謝的增強情況[19]。由圖8可以看出，在溫度為8℃時乳酸通量較高；在內果肉中，50℃時也有較高的乳酸通量；在中果肉和外果肉中溫度高于20℃時乳酸通量有下降的趨勢。在內果皮中溫度從8℃開始出現乳酸通量先下降然后再上升的趨勢，在55℃時出現較低的乳酸通量；在外果皮中乳酸通量隨溫度呈現波動的趨勢。結果顯示，處于8℃時乳酸通量較高，更有利于限制呼吸代謝并促進蔗糖的合成。

3 結論與討論

本實驗進行了不同溫度下甜瓜的蔗糖和乳酸代謝網絡通量分析，結果表明：蔗糖的代謝通量在不同溫度貯藏時有較大的不同，在8℃時蔗糖合成通量較高，甜瓜的糖分解代謝處于較低狀態；并且在40～50℃的范圍內也出現了較高的蔗糖通量，尤其是在中果肉、外果肉和內果皮三個部位，這說明一定的高溫處理可能會起到更好的保鮮效果。這樣的原因可能是果實經過短時間高溫處理之后產生的應激反應[28]。而在55℃時蔗糖通量開始下降，其中的原因可能是溫度過高而導致其相關的酶的合成量降低以適應高溫度對自身造成的損傷。果實經過適當的熱處理之后置于較低溫度的環境下會起到更好的貯藏效果，且一般認為處理溫度在30～52℃是最佳的熱處理溫度[29]，結合本實驗中蔗糖在高溫區域的通量變化，很有可能50℃就是甜瓜熱處理的最適溫度，這也與張輝等研究的結果相一致[30]。乳酸在果蔬的貯藏保鮮中發揮重要作用[16]，它的通量反映了呼吸代謝的受限狀態和合成代謝的增強情況，如結果所示，8℃條件下乳酸通量較高，此溫度下貯藏更有利于降低呼吸代謝，增加蔗糖的合成代謝，而蔗糖的通量在8℃也是最高的，因此從代謝的角度講8℃是甜瓜的最適貯藏溫度。在內果肉和外果皮部位，較高溫度時也有較高的乳酸通量，適當的高溫也有利于降低呼吸代謝，延長貯藏時間。根據所得到的結果，從代謝的角度優化貯藏保鮮的條件和方法為果蔬貯藏保鮮提供新的研究思路。

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Effects of different temperature on sugar and lactic acid flux in melon

WANG Hui-song，PANG Guang-chang*，LIU Ting-ting
（College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

From the perspective of metabolism，fresh-keeping actually was to reduce catabolism of fruits and vegetables in their living condition so that their shelf life were prolonged，in-depth research of the law of metabolic flux will achieve the purpose better.This study used melon as a test subject discussed the law of metabolic flux of fruits and vegetables during their storage.In order to obtain the metabolic flux of the following pathways：embden meyerhof pathway（EMP），pentose phosphate pathway（PPP），sucrose synthesis pathway（SSP）and TCA cycle（TCA），melon was stored at different temperatures（0，5，8，10，20，30，40，45，50，55℃）. The results showed that sucrose had a higher synthesis flux at the temperatures of 8℃and 50℃，and lactate had a higher metabolic flux at the temperature of 8℃.Thus，8℃was the optimal storage temperature.These findings would be enable to provide the reference for the in-depth study fruits and vegetables storage from the perspective of metabolic，improve the quality of the fruit store.

melon；sugar；lactate；metabolic flux

TS255.1

A

1002-0306（2015）22-0344-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.062

2015－03－09

王會松（1990-），男，碩士研究生，研究方向：代謝工程，E-mail：master.whs@hotmail.com。

*通訊作者：龐廣昌（1956-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：pgc@tjcu.edu.cn。

國家自然科學基金面上項目（31371773）。