祁門紅茶多酚提取工藝優(yōu)化及其組成鑒定

安曉婷，陳 靜，謝小花，肖陸飛

（滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，安徽滁州239000）

祁門紅茶多酚提取工藝優(yōu)化及其組成鑒定

安曉婷，陳 靜，謝小花，肖陸飛*

（滁州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，安徽滁州239000）

以祁門紅茶為原料，優(yōu)化了紅茶多酚提取的工藝條件。通過單因素實驗考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比、pH對紅茶多酚提取率的影響，并進(jìn)一步采用正交實驗優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度70℃，提取時間2.5 h，料液比1∶50（g/mL），pH4。在此工藝下，提取兩次后紅茶多酚提取率為（214.23± 6.29）mg/g。采用UPLC-DAD鑒定祁門紅茶的多酚組成，結(jié)果表明，祁門紅茶多酚的主要成分為沒食子酸、沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯、茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3′-沒食子酸酯和茶黃素雙沒食子酸酯。

祁門紅茶，多酚，提取工藝，兒茶素，茶黃素

茶葉中富含茶多酚，茶多酚是天然抗氧化劑，具有重要的生物活性，它賦予了茶葉獨特的保健和藥用價值[1]。紅茶為全發(fā)酵茶，發(fā)酵度約為80%～90%。紅茶在發(fā)酵過程中，兒茶素在酶促氧化和非酶促氧化的作用下聚合成一系列有色化合物，如茶黃素、茶紅素、茶褐素等[2]。因此，與綠茶相比，紅茶的兒茶素含量相對較低。研究證明，作為兒茶素的主要氧化產(chǎn)物，茶黃素和茶紅素的生物活性并未降低，其仍然具有良好的抗氧化活性[3]。另有研究指出，茶黃素甚至比兒茶素表現(xiàn)出強的抗腫瘤、抗菌活性[4-5]。因此，除兒茶素外，茶黃素也是紅茶中的重要生物活性成分。

隨著人們健康觀念的增強，作為我國消費量最大的茶類之一，紅茶多酚的生物學(xué)功能受到越來越廣泛的關(guān)注。提取是制備紅茶多酚的第一步，目前，學(xué)者多采用浸提法和超聲波輔助提取法提取紅茶多酚。劉萍等優(yōu)化了滇紅紅茶多酚的浸提工藝，得到最佳工藝參數(shù)為固液比1∶50，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，浸提溫度50℃，浸提時間30 min，在此條件下，紅茶多酚提取率為20.35%[6]。劉慧娟等通過正交實驗得到英德紅茶茶多酚提取最佳工藝條件為固液比1∶50，pH5.0，浸提溫度90℃，浸提時間10 min，此時紅茶多酚提取率為13.8%[7]。唐淯桓等通過響應(yīng)面實驗優(yōu)化了日照紅茶多酚的超聲提取工藝，得到最佳工藝為超聲時間80 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)88.99%，靜止萃取時間89.97 min，超聲溫度80℃，在此工藝下，紅茶多酚提取率高達(dá)73.5%[8]。

作為世界四大紅茶品種之一，祁門紅茶多酚的提取工藝少見報道。本文通過正交實驗優(yōu)化了祁門紅茶多酚的提取工藝，并通過超高液相色譜（UPLC）分析其多酚組成，為開發(fā)和利用祁門紅茶多酚資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

祁門紅茶（小種紅茶） 于2014年3月底采自安徽省蕪湖市三山區(qū)峨橋鎮(zhèn)茶廠，購自安徽省東吳茶葉有限公司；沒食子酸（Gallic acid，GA）、沒食子兒茶素（（-）-Gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（（-）-Epigallocatechin，EGC）、兒茶素（（+）-Catechin，C）、表兒茶素（（-）-Epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-Epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-Gallocatechin gallate，GCG），表兒茶素沒食子酸酯（（-）-Epicatechin gallate，ECG）和兒茶素沒食子酸酯（（-）-Catechin gallate，CG）、茶黃素（Theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin 3-gallate，TF3G）、茶黃素-3′-沒食子酸酯（Theaflavin 3’-gallate，TF3′G）和茶黃素雙沒食子酸酯（Theaflavin 3，3’-digallate，TF33′G）等13種茶多酚標(biāo)品 均購自美國Sigma-Aldrich；咖啡因（Caffeine）和Folin-Ciocalteu試劑 購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 1290 Infinity LC超高液相色譜儀 美國Agilent公司；52S紫外可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；THZ-Q臺式冷凍恒溫振蕩器 太倉市華美生化儀器廠；DD-5M湘儀離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚含量的測定 根據(jù)Folin-Ciocalteu法[9]測定提取液中的多酚含量。用80%乙醇配制質(zhì)量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的沒食子酸溶液。各取200 μL不同質(zhì)量濃度沒食子酸溶液，加入2 mL Folin-Ciocalteu試劑混勻，靜置4 min后，加入2 mL 75 mg/mL的碳酸鈉溶液，暗處反應(yīng)2 h，測定760 nm處吸光度值。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y= 6.9779X+0.0237，R2=0.9997，其中X為沒食子酸濃度（mg/mL），Y為760 nm處的吸光度。精確移取用80%乙醇適當(dāng)稀釋后的紅茶提取液200 μL，按照上述步驟顯色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多酚質(zhì)量濃度，并進(jìn)一步計算多酚提取率。

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出提取液中多酚濃度/（mg/mL）；V為提取液液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；W為紅茶質(zhì)量/g。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅茶多酚提取率的影響 稱取1.0 g祁門紅茶，按料液比1∶30（g/mL）加入pH=4的不同體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）的乙醇溶液，60℃下振蕩提取1 h，提取液在5000 r/min下離心10 min。取上清液在100 mL棕色容量瓶中定容，適當(dāng)稀釋后取200 μL按照方法1.2.1顯色，計算多酚提取率Y。

1.2.2.2 提取溫度對紅茶多酚提取率的影響 稱取1.0 g祁門紅茶，按料液比1∶30（g/mL）加入pH=4，體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，分別在不同溫度下（30、40、50、60、70、80℃）下振蕩提取1 h，提取液在5000 r/min下離心10 min。取上清液在100 mL棕色容量瓶中定容，適當(dāng)稀釋后取200 μL按照方法1.2.1顯色，計算多酚提取率Y。

1.2.2.3 提取時間對紅茶多酚提取率的影響 稱取1.0 g祁門紅茶，按料液比1∶30（g/mL）加入pH=4，體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，分別在70℃下振蕩提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取液在5000 r/min下離心10 min。取上清液在100 mL棕色容量瓶中定容，適當(dāng)稀釋后取200 μL按照方法1.2.1顯色，計算多酚提取率Y。

1.2.2.4 料液比對紅茶多酚提取率的影響 稱取1.0 g祁門紅茶，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）加入pH=4，體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，在70℃下振蕩提取2 h，提取液在5000 r/min下離心10 min。取上清液在100 mL棕色容量瓶中定容，適當(dāng)稀釋后取200 μL按照方法1.2.1顯色，計算多酚提取率Y。

1.2.2.5 pH對紅茶多酚提取率的影響 稱取1.0 g祁門紅茶，按料液比1∶40（g/mL）加入不同pH（2、3、4、5、6、7、8）、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，分別在70℃下振蕩提取2 h，提取液在5000 r/min下離心10 min。取上清液在100 mL棕色容量瓶中定容，適當(dāng)稀釋后取200 μL按照方法1.2.1顯色，計算多酚提取率Y。

1.2.3 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比等4個對紅茶多酚提取率有顯著影響的因素進(jìn)行L9（34）正交實驗，正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.4 提取次數(shù)對紅茶多酚提取率的影響 稱取1.0 g祁門紅茶，按照正交實驗優(yōu)化工藝，分別提取1、2、3、4次，合并提取液在5000 r/min下離心10 min。取上清液在250 mL棕色容量瓶中定容，適當(dāng)稀釋后取200 μL按照方法1.2.1顯色，計算多酚提取率Y。

1.2.5 UPLC-DAD條件 采用UPLC-DAD檢測祁門紅茶多酚提取液中咖啡因、沒食子酸、兒茶素和茶黃素。色譜柱：Zorbax SB-C18反相色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm），美國Agilent公司。以含0.1%甲酸的水溶液為流動相A，含0.1%甲酸的乙腈溶液為流動相B，流速0.4 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為2.5 μL。按照如下梯度洗脫：0～5 min，2%～10%B；5～8 min，10%～15%B；8～15 min，15%～50%B；15～20 min，50%～70%B；20～25 min，70%～85%B；25～35 min，85%B；Post Run 5 min。采用DAD檢測器，檢測波長為278 nm。混合標(biāo)準(zhǔn)品Caffeine、GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG、TF1、TF3G、TF3′G、TF33′G和紅茶多酚提取液適當(dāng)稀釋后過0.22 μm濾膜后上樣檢測。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 14.0軟件，采用ANOVA法進(jìn)行顯著性檢驗。選取p＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅茶多酚提取率的影響 從圖1可以看出，在乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%之間時，多酚提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而提高，在60%時，紅茶多酚提取率達(dá)到最高值，為（180.07± 3.51）mg/g。進(jìn)一步提高乙醇濃度，多酚提取率顯著降低。采用純乙醇為溶劑時提取率最低，為（110.6± 7.57）mg/g。乙醇的體積分?jǐn)?shù)對黃酮、原花青素、花色苷[10-12]等多酚化合物具有重要影響。適當(dāng)?shù)囊掖俭w積分?jǐn)?shù)可以改善提取溶劑的極性，有利于多酚的浸出。多酚在植物細(xì)胞內(nèi)經(jīng)常通過氫鍵與蛋白質(zhì)、纖維素等結(jié)合在一起，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過低，溶劑破壞氫鍵的能力低，導(dǎo)致提取率下降[13]。而乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，提取溶劑極性太小，也不利用多酚化合物的浸出。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅茶多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of black tea polyphenols

2.1.2 提取溫度對紅茶多酚提取率的影響 提取溫度對紅茶多酚提取率的影響由圖2所示，當(dāng)提取溫度在30～70℃之間時，多酚提取率隨提取溫度的升高顯著增加，當(dāng)溫度高于70℃時，多酚提取率隨提取溫度的升高略有下降。適宜的高溫可以使分子運動加劇，加快紅茶多酚的滲透、溶解和擴散速度[14]，而過高的溫度會引起多酚化合物一系列的氧化、降解反應(yīng)，從而降低多酚提取率。因此，選擇70℃為最佳提取溫度。

圖2 提取溫度對紅茶多酚提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the extraction efficiency of black tea polyphenols

2.1.3 提取時間對紅茶多酚提取率的影響 從圖3可以看出，在2 h內(nèi)，多酚提取率隨時間增加而增加，在2 h時達(dá)到最高值，為（210.80±7.50）mg/g。繼續(xù)延長提取時間至2.5 h，多酚提取率無明顯變化。當(dāng)提取時間為3 h時，多酚提取率降至（199.81±3.38）mg/g。在提取過程中，茶多酚在高溫條件下與氧氣的接觸，過長的提取時間加劇了茶多酚的氧化、降解[15]，反而不利用多酚提取。

圖3 提取時間對紅茶多酚提取率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction efficiency of black tea polyphenols

圖4 料液比對紅茶多酚提取率的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of black tea polyphenols

2.1.4 料液比對紅茶多酚提取率的影響 從圖4可以看出，當(dāng)料液比在1∶10～1∶40之間時，多酚提取率隨著提取溶劑體積的增加而顯著提高。繼續(xù)增加溶劑的用量對多酚提取率無顯著影響，而溶劑用量過多會造成資源浪費且不利用后續(xù)的分離純化工作，因此選擇最佳料液比為1∶40（g/mL）。

2.1.5 pH對提取率的影響 兒茶素是紅茶多酚的重要組成成分，兒茶素特別是EGCG對堿性條件敏感。在堿性條件下，兒茶素分子中酚羥基電離，易發(fā)生氧化反應(yīng)[16]，導(dǎo)致多酚提取率的下降。如圖5所示，在酸性提取溶劑（pH2～6）中，紅茶多酚提取率均較高且差異不明顯，pH4時提取率最高，為（209.23±2.61）mg/g。而在中性（pH7）和堿性提取溶劑（pH8）中，紅茶多酚提取率相對于酸性提取溶劑顯著下降。因此，選擇pH4為提取溶劑最佳pH。

圖5 pH對紅茶多酚提取率的影響Fig.5 Effect of pH on the extraction efficiency of black tea polyphenols

2.2 正交實驗優(yōu)化紅茶多酚提取工藝

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取對紅茶多酚提取率影響較大的四個因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間、料液比，按照表1中因素水平，采用L9（34）正交實驗優(yōu)化紅茶多酚提取工藝。由表2可知，各因素對實驗影響大小的順序為A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞B（提取溫度）＞C（提取時間）＞D（料液比）。紅茶多酚的最佳提取工藝組合為A2B2C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度70℃，提取時間2.5 h，料液比1∶50（g/mL）。方差分析（表3）表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對紅茶多酚提取率影響極顯著（p＜0.01），提取溫度和提取時間對紅茶多酚提取率影響顯著（p＜0.05），而料液比對紅茶多酚提取率影響不顯著。

表2 紅茶多酚提取工藝正交實驗優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design arrangement and corresponding results

表3 正交實驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal array design

依照上述優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行3次平行實驗，得到平均多酚提取率為（214.23±6.29）mg/g。結(jié)果表明，采用該工藝提取紅茶多酚提取率高且穩(wěn)定性好。

2.3 提取次數(shù)對紅茶多酚提取率的影響

圖6 提取次數(shù)對紅茶多酚提取率的影響Fig.6 Effect of number of extractions on the extraction efficiency of black tea polyphenols

從圖6可知，相對于提取1次，提取2次可以顯著提高紅茶多酚提取率。2次提取后多酚提取率為（234.78±3.36）mg/g，繼續(xù)增加提取次數(shù)，對紅茶多酚提取率無顯著影響，因此選擇最佳提取次數(shù)為2次。

2.4 UPLC分析紅茶多酚組成

圖7 祁門紅茶多酚UPLC圖譜Fig.7 UPLC chromatograms of keemun black tea polyphenols

如圖7所示，祁門紅茶多酚在UPLC中得到快速、精確的分離。通過與混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比對，共有11種化合物得到鑒定。按照保留時間順序，依次為沒食子酸（GA）、沒食子兒茶素（GC）、咖啡因（Caffeine）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、兒茶素沒食子酸酯（CG）、茶黃素（TF1）、茶黃素-3-沒食子酸酯（TF3G）、茶黃素-3′-沒食子酸酯（TF3′G）和茶黃素雙沒食子酸酯（TF33′G）。

綠茶為未發(fā)酵茶，茶黃素含量甚微。而紅茶為全發(fā)酵茶，在發(fā)酵過程中，兒茶素在酶促氧化和非酶促氧化的作用下生成茶黃素等聚合物[17]，因此紅茶中茶黃素含量顯著高于綠茶。如圖7所示，祁門紅茶中四種茶黃素單體（TF1、TF3G、TF3′、TF33′G）含量較高。發(fā)酵同時造成了兒茶素的損失，因此紅茶兒茶素含量低于綠茶。祁門紅茶中只檢測到GC、EC、EGCG、ECG、CG等5種兒茶素單體（圖7），而另外3種綠茶中常見的兒茶素單體如C、EGC、GCG等未得到鑒定。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)之上，通過正交實驗優(yōu)化了祁門紅茶多酚提取工藝，得到最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度70℃，提取時間2.5 h，料液比1∶50（g/mL），pH4，提取2次。在此條件下，紅茶多酚的提取率為（214.23±6.29）mg/mL。通過UPLC進(jìn)一步鑒定了祁門紅茶多酚主要組成為沒食子酸（GA）、5種兒茶素單體（GC、EC、EGCG、ECG、CG）和4種茶黃素單體（TF1、TF3G、TF3′、TF33′G）。

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Optimization of extraction technology of keemun black tea polyphenols and its composition identification

AN Xiao-ting，CHEN Jing，XIE Xiao-hua，XIAO Lu-fei*
（Department of Food and Environmental Engineering，Chuzhou Vocational and Technical College，Chuzhou 239000，China）

The extraction technology of black tea polyphenols was optimized using keemun black tea as material. The effect of ethanol concentration，extraction temperature，extraction time，solid-liquid ratio，pH on extraction yield was investigated by single-factor experiment and the extraction technology was further optimized by orthogonal experiment.The optimum extraction parameters were as follows：ethanol concentration 60%，extraction temperature 70℃，extraction time 2.5 h，and solid-liquid ratio 1∶50（g/mL）.The extraction yield was（214.23±6.29）mg/g after the second extraction.In addition，UPLC-DAD was applied to identify keemun black tea polyphenols.Results showed that the main components of keemun black tea polyphenols were gallic acid，（-）-Gallocatechin（GC），（-）-Epicatechin（EC），（-）-Catechin gallate（CG），（-）-Epicatechin gallate（ECG），（-）-Epigallocatechin gallate（EGCG），Theaflavin（TF1），Theaflavin 3-gallate（TF3G），Theaflavin 3’-gallate（TF3′G）and Theaflavin 3，3’-digallate（TF33′G）.

keemun black tea；polyphenols；extraction technology；catechin；theaflavin

TS207.3

B

1002-0306（2015）22-0231-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.040

2015－03－01

安曉婷（1986-），女，碩士，助教，研究方向：營養(yǎng)與功能因子，E-mail：anxiaotin@163.com。

*通訊作者：肖陸飛（1976-），男，博士，副教授，研究方向：有機合成，E-mail：foodjys@126.com。

安徽省卓越人才培養(yǎng)計劃（2013zjjh051）；安徽省省級示范實驗實訓(xùn)中心建設(shè)項目（20101427）。