響應面法優化山杏核殼總多酚提取工藝及其性質研究

萬 山，楊 喆，張喬會，歐陽杰，王建中

（北京林業大學，北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083）

工藝技術

響應面法優化山杏核殼總多酚提取工藝及其性質研究

萬 山，楊 喆，張喬會，歐陽杰，王建中*

（北京林業大學，北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083）

以山杏核殼為原料，利用閃式提取技術提取山杏核殼中的多酚類化合物，以單因素實驗結果為依據，通過響應面分析法對閃提工藝進行優化，最終得到修正后的較優提取工藝參數為：乙醇溶液體積分數63%，提取時間4.2 min，液料比23∶1，提取溫度61℃。此工藝參數下山杏核殼總多酚率為736.87 mg（GAE）/100 g。通過對紅外吸收峰的分析，發現樣品含有多酚類化合物的典型基團。通過綜合熱重分析儀測定樣品熱穩定性，在240℃以內穩定，在240～580℃范圍內發生熱解。

山杏核殼，多酚，響應面法，熱重分析，紅外

山杏（Armeniaca sibirica）是一種生態型經濟樹種，主要生長于亞洲，我國分布區域為內蒙古、吉林、遼寧、甘肅、河北、山西等地，分布廣泛，資源豐富。山杏核殼作為山杏加工過程中的廢料被大量丟棄，造成資源的浪費，可利用山杏核殼這一生物資源，人們將山杏殼制備活性炭[1]，制備木醋液[2]等，研究山杏核殼中的黑色素、總黃酮等[3-4]，但從山杏核殼中提取多酚類化合物及其性質研究的報道尚少。多酚類化合物具有多種生物活性，具有延緩機體衰老及預防、治療心血管疾病、防癌、抗輻射等，對人體健康有著積極作用[5]，可用于食品和醫藥領域[6-7]。植物類多酚的提取方法通常有熱回流法和浸提法[8]，所需時間較長，得率不穩定。閃式提取有溶劑用量小，提取時間短，效率高等特點，能夠最大限度保留提取物有效成分。本研究以山杏核殼為原料，通過響應面分析法優化山杏核殼總多酚閃式提取工藝條件，并通過紅外光譜儀和綜合熱重分析儀，探究其相關理化性質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山杏核殼 購自北京延慶；沒食子酸標準品 天津市津科精細化工研究所；無水乙醇、無水碳酸鈉、福林酚試劑等 均為分析純。

JHBE-50S閃式提取器 北京金鼐科技發展有限公司；Tensor27型FT-IR紅外光譜儀 德國Bruker公司；TGA60熱重分析儀 日本Shimadzu公司；FA2004電子天平 上海上平儀器有限公司；SHZ-III循環水式多用真空泵 上海知信實驗儀器技術有限公司；T6新世紀型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；R-210旋轉蒸發儀 上海申順生物科技有限公司；TD5A臺式低速離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；DZF真空干燥箱 上海龍躍儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚標準曲線的制作 精密稱取120℃真空干燥至恒重的沒食子酸標準品10.0 mg，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準品溶液。精密吸取沒食子酸標準品溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL分別置于25 mL容量瓶中，分別加入福林酚試劑3 mL，搖勻，靜置30 s，再分別加入10%碳酸鈉溶液6 mL，搖勻，定容至刻度，避光靜置2 h。以第一個樣品為空白樣，在760 nm波長處測定其余樣品吸光度A，以濃度C為橫坐標，以吸光度值A為縱坐標，繪制標準曲線[9]。

1.2.2 山杏核殼總多酚得率測定 將山杏核殼用粉碎機粉碎，過60目篩，準確稱取10.0 g，加入一定量乙醇溶液，在一定條件下進行閃式提取，過濾，測定濾液體積。取1 mL上述濾液于25 mL容量瓶中，以制備標準曲線的方法，即福林酚-碳酸鈉顯色法顯色，在760 nm處測定其吸光度，并利用回歸方程確定山杏核殼樣品中總多酚得率，總多酚得率以每100 g干質量等同于沒食子酸的毫克數表示。

1.2.3 單因素實驗設計 以乙醇體積分數、閃提時間、液料比、提取溫度四個因素為研究對象，以山杏核殼中總多酚得率為指標，進行單因素實驗。

1.2.3.1 乙醇的體積分數對得率的影響 準確稱取5份處理好的山杏核殼粉，每份10.0 g，分別加入體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，以20∶1的液料比，在50℃的溫度下提取3 min。

1.2.3.2 提取時間對得率的影響 準確稱取5份處理好的山杏核殼粉，每份10.0 g，加入體積分數為60%的乙醇溶液，以20∶1的液料比，在50℃的溫度下分別提取1、2、3、4、5 min。

1.2.3.3 液料比對得率的影響 準確稱取5份處理好的山杏核殼粉，每份10.0 g，加入體積分數為60%的乙醇溶液，分別以10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的液料比，在50℃的溫度下提取4 min。

1.2.3.4 提取溫度對得率的影響 準確稱取5份處理好的山杏核殼粉，每份10.0 g，加入體積分數為60%的乙醇溶液，以20∶1的液料比，分別在30、40、50、60、70℃的溫度下提取4 min。

1.2.4 響應面實驗設計 為分析各影響因素間的交互作用對山杏核殼總多酚得率的影響，結合單因素實驗的結果，分別選取以乙醇體積分數、提取時間、液料比、提取溫度為實驗因素，以山杏核殼總多酚得率為響應值，根據Box-Benhnken中心組合設計原理，運用Design Expert 7.0軟件進行四因素三水平響應面實驗設計，確定最佳實驗條件。實驗因素及水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels in single-factor design

1.2.5 山杏核殼總多酚的紅外分析[10-11]取少量樣品置于紅外光譜儀中進行測定，掃描分辨率2 cm-1，掃描范圍為4000～400 cm-1，掃描次數32次。

1.2.6 山杏核殼總多酚的熱穩定性分析[12-13]為考察山杏核殼總多酚的熱穩定性，準確稱取少量的山杏核殼總多酚（3～8 mg），放入綜合熱重分析儀內對其進行熱TG/DTG分析測定。分析條件：掃描溫度為20～600℃，升溫速度為10℃/min，N2流速為40 mL/min。

1.3 數據處理

實驗數據的處理分別采用Microsoft Excle（Office 2007）、Design Expert 7.0等軟件進行。

2 結果與分析

2.1 標準曲線制作

得到標準曲線，如圖1所示，得到回歸方程：C= 0.1493A-0.0015（R2=0.9997）。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curves

圖2 乙醇體積分數對總多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 乙醇體積分數的選擇 提取溶劑乙醇的體積分數對山杏核殼總多酚得率的影響如圖2所示。結果顯示，山杏核殼總多酚得率隨著乙醇體積分數的增加而升高，當乙醇體積分數達到60%時，得率達到最高，之后隨著提取溶劑乙醇體積分數的增加，山杏核殼總多酚得率逐漸下降，乙醇濃度過高不利于水溶性多酚類物質的析出，并且會使蛋白質等生物大分子變性沉淀，阻礙多酚類物質從組織細胞向容劑中擴散[14]。

2.2.2 閃提時間的選擇 閃式提取時間對山杏核殼總多酚得率的影響如圖3所示。隨著閃提時間的不斷增加，山杏核殼總多酚得率不斷升高，當閃提時間達到4 min時，得率達到最高，之后繼續增加提取時間，山杏核殼總多酚得率略有下降，提取時間過長，閃式提取器刀頭高速旋轉產生大量熱，易發生氧化反應，破壞了多酚類物質。

圖3 閃提時間對總多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols

2.2.3 提取溫度的選擇 不同提取溫度對山杏核殼總多酚得率的影響如圖4所示。隨著提取溫度不斷上升，山杏核殼總多酚得率不斷升高，提取溫度為60℃時得率達到最高，隨后溫度的增加，得率略有下降，提取溫度過高，易氧化變質，影響多酚類物質提取得率[15]。

圖4 溫度對總多酚得率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction rate of polyphenols

2.2.4 液料比的選擇 不同液料比對山杏核殼總多酚得率的影響如圖5所示。結果顯示，山杏核殼總多酚得率隨著液料比的增加而升高，當液料比達到20∶1時，得率達到最高，之后繼續增加液料比，山杏核殼總多酚得率無明顯變化。

圖5 液料比對總多酚得率的影響Fig.5 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of polyphenols

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Program and experimental results of response surface methodology

2.3 響應面法實驗結果

2.3.1 山杏核殼總多酚閃提工藝回歸模型的建立以單因素實驗結果為依據，以乙醇體積分數（A）、閃提時間（B）、液料比（C）、溫度（D）為自變量，以山杏核殼總多酚得率（Y）為響應值設計響應面實驗，結果如表2所示。采用Design Expert 7.0軟件，對表2中的實驗數據進行回歸分析，得出山杏核殼總多酚得率的回歸方程：

Y=715.80+14.00A+26.42B+76.92C+16.67D+ 31.50AB-10.50AC+3.50AD-21.00BC-6.75BD-3.25CD-29.90A2-61.52B2-69.02C2-52.65D2。

2.3.2 山杏核殼總多酚閃提工藝回歸模型方差分析 對2.3.1中得到的回歸方程進行方差分析，結果如表3所示。

通過表3可以直觀看到，模型的二次項B2、C2、D2和一次項C達到極顯著水平，p＜0.0001；二次項A2和一次項B達到高度顯著水平，p＜0.01；另外D和AB兩項達到顯著水平，p＜0.05。結果表明，該模型下響應值變化復雜，各自變量影響因素對響應值的影響不是簡單的線性影響。

通過表3還可以看到，模型顯著性檢驗為極顯著，p＜0.0001，失擬項p為0.0510＞0.05，無失擬因素存在，因此說明該模型與實驗擬合度良好。該回歸方程相關系數R2=0.9523，校正決定系數R2Adj=0.9046，說明該模型能夠解釋95.23%的變化，因此進一步說明該模型具與實驗有較好的擬合度，可通過該回歸方程對實驗結果進行分析及預測。

圖6 Y=f（A，B）的響應曲面圖Fig.6 Responsive surfaces of Y=f（A，B）

圖7 Y=f（A，C）的響應曲面圖Fig.7 Responsive surfaces of Y=f（A，C）

通過表3實驗結果可知，各自變量影響因素對響應值的影響大小順序為：乙醇體積分數（A）＜提取溫度（D）＜提取時間（B）＜液料比（C）。

2.3.3 響應面分析 響應曲面反映的是兩個不同影響因素之間的交互作用。通過Design Expert 7.0軟件，將乙醇體積分數、閃提時間、液料比例、閃提溫度四個因素分別進行兩兩比較分析，圖6～圖11為各因素間交互作用的響應曲面圖及相應等高線圖。乙醇體積分數與提取時間之間的交互作用及乙醇體積分數與液料比之間的交互作用，對山杏核殼總多酚得率的影響非常大；乙醇體積分數與提取溫度之間的交互作用對山杏核殼總多酚得率影響最大且顯著，其它因素間交互作用對山杏核殼總多酚得率有一定影響但均不顯著。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

2.3.4 最佳閃提工藝條件的確定 通過Design Expert 7.0軟件對山杏核殼總多酚的閃式提取工藝條件進行優化，進一步得到較優工藝參數為：提取溶劑乙醇的體積分數為62.52%，閃提時間為4.19 min，液料比為22.53∶1，提取溫度為61.40℃，此條件下，山杏核殼總多酚得率的預測值為740.64（mg（GAE）/100g）。為便于實驗操作，在實際操作中將以上工藝參數修正為：提取溶劑乙醇的體積分數為63%，閃提時間為4.2 min，液料比為23∶1，提取溫度為61℃，并在此工藝參數條件下進行三次平行實驗，實際測得山杏核殼總多酚提取得率平均約為736.87（mg（GAE）/100g），與預測值相差很小，說明該模型與實際擬合度良好，用于預測實驗結果比較可靠，可用于山杏核殼總多酚提取工藝的優化。

圖9 Y=f（B，C）的響應曲面圖Fig.9 Responsive surfaces of Y=f（B，C）

圖10 Y=f（B，D）的響應曲面圖Fig.10 Responsive surfaces of Y=f（B，D）

圖11 Y=f（C，D）的響應曲面圖Fig.11 Responsive surfaces of Y=f（C，D）

2.4 山杏核殼總多酚紅外結果分析

山杏核殼提取樣品的紅外光譜圖如圖12所示，樣品圖譜中在3368.97 cm-1處有較寬的吸收峰，是-OH伸縮振動峰，說明樣品化學結構中存在羥基；2936.52 cm-1處有較弱的C-H伸縮振動峰，說明飽和碳上的氫較少；1660.02 cm-1處的吸收峰是羰基伸縮振動造成的，推測其為酮羰基；1510.45、1455.99 cm-1兩處的吸收峰是苯環中C=C的伸縮振動峰；1000～800 cm-1處的吸收峰可能是苯環上取代基引起的。綜上所述，樣品的化學結構含有典型的酚類化合物基團，吸收峰位置基本吻合，因此能夠證明樣品為山杏核殼總多酚。

圖12 山杏核殼總多酚紅外光譜圖Fig.12 IR spectrum of polyphenols from shell of wild apricot

2.5 山杏核殼總多酚熱穩定性結果分析

多酚標準品與山杏核殼總多酚的熱重分析結果如圖13所示。從TGA曲線可以看出多酚標準品有兩個明顯的失重峰，其中第一個失重峰出現在80℃左右，失重率為8.91%，這可能是由于標準品中含有一定的水分，加熱失水造成的失重；多酚標準品失重主要發生在第二個失重峰階段，溫度在240～380℃之間，失重率為62.48%，說明酚類化合物在該溫度范圍內不穩定。從山杏核殼總多酚樣品的TGA曲線可以看出，與多酚標準品的失重曲線基本一致，240℃之前較為穩定，主要失重階段位于240～390℃之間，失重率為32.22%；同時，在390～580℃之間還存在一個失重峰，失重率為18.75%，這可能是由于山杏核殼總多酚樣品中存在雜質，溫度達到390℃之后雜質開始失重，進而出現第二個失重峰。樣品反應結束后總失重率約為59.78%，剩余物質質量略高于標準品，這可能是由于樣品存在雜質，當溫度升高至600℃時仍未達到雜質的熱解溫度，從而使雜質殘留下來，導致剩余物質質量增加。

3 結論

3.1 采用閃式提取法對山杏核殼中的多酚類物質進行提取，通過Box-Benhnken中心組合實驗設計原理建立提取工藝優化回歸方程模型。經方差分析該模型擬合度良好，經修正后得到較優提取工藝參數為：提取溶劑乙醇的體積分數為63%，閃提時間為4.2 min，液料比為23∶1，提取溫度為61℃，此時，山杏核殼總多酚提取平均得率為736.87 mg（GAE）/100 g。

圖13 山杏核殼總多酚失重圖（氮氣保護）Fig.13 TGA analysis of polyphenols from shell of wild apricot（under N2condition）

3.2 樣品的紅外吸收峰圖譜顯示，樣品含有多酚類化合物的典型基團，吸收峰位置基本吻合，因此可說明，本實驗所提取得到的物質為山杏核殼中的多酚類化合物。熱重力分析結果顯示，山杏核殼總多酚在240℃之前較為穩定，加熱至240℃之后發生熱解，主要失重峰位于240～390℃之間，與多酚標準品基本一致。

[1]齊高強，趙忠，馬希漢，等.山杏殼制備活性炭的最佳工藝研究[J].林產化工，2013（4）：49-52.

[2]施琳.山杏殼木醋液有效成分及生物活性研究[D].西安：西北農林科技大學，2013.

[3]楊喆，萬山，張喬會，等.響應面法優化山杏核殼總黃酮提取工藝及其抗氧化研究[J].食品工業科技，2015，36（6）：279-284.

[4]李軍，張喬會，藍晶晶，等.響應面法對山杏核殼黑色素提取工藝的研究[J].食品工業科技，2012（2）：295-299.

[5]蔡茜彤，范金波，馮敘橋，等.微波輔助提取牛蒡多酚和黃酮工藝優化及抗氧化活性的研究[J].食品工業科技，2015，36（4）：275-280.

[6]任亞梅，李光輝，許永濤.石榴籽多酚的提取及其種殼種仁抗氧化活性研究[J].食品科學，2012，33（4）：31-35.

[7]Samad N B，Debnath T，Jin H L，et al.Antioxidant activity of Benincasa hispida seeds[J].Journal of Food Biochemistry，2013，37（4）：388-395.

[8]Sales J M，Resurreccion A V A.Maximising resveratrol and piceid contents in UV and ultrasound treated peanuts[J].Food chemistry，2009，117（4）：674-680.

[9]朱素英.基于響應曲面法優化天麻多酚的提取工藝[J].食品工業科技，2015，36（1）：268-271.

[10]王超，伍賢學，張群，等.三種市售苦丁茶的紅外光譜分析鑒定[J].玉溪師范學院學報，2014，4：006.

[11]沈玫，胡江濱，閆超.綠茶中茶多酚的分析方法研究進展[J].藥物評價研究，2013（5）：389-393.

[12]任虹，薛宏亮，李婷，等.超聲波輔助提取花生紅衣多酚及其抗氧化活性研究[J].中國糧油學報，2015，30（1）：117-123.

[13]王曉陽，唐琳，趙壘.響應面法優化刺槐花多酚的超聲提取工藝[J].食品科學，2011，32（2）：66-70.

[14]劉燦，榮永海，王志濱，等.閃式提取法提取羅漢果多酚[J].食品科學，2010（22）：50-53.

[15]徐朝芬，孫學信，郭欣.熱重分析實驗中影響熱重曲線的主要因素分析[J].熱力發電，2005，34（6）：34-36.

Study on optimization of extraction of polyphenols from shell of wild apricot by response burface methodology and its characterization

WAN Shan，YANG Zhe，ZHANG Qiao-hui，OUYANG Jie，WANG Jian-zhong*
（Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

The shell of wild apricot were used as the raw material to extract polyphenols by flash-extraction，based on single factor experiments，extraction condition was optimized by response surface methodology.The results showed that the optimum conditions of extraction of the polyphenols from shell of wild apricot were as follows：63%ethanol concentration，4.2 min extraction time，23∶1 liquid/material ratio and 61℃ extraction temperature.Under this condition，the maximal content of polyphenols was up to 736.87 mg（GAE）/100 g.The results showed that the extracts contained the typical groups of polyphenols and it was stable under 240℃and occured of pyrolysis reaction in the temperature range of 240～580℃.

shell of wild apricot；polyphenols；response surface methodology；thermal gravity analysis；infrared radiation

TS201.1

B

1002-0306（2015）22-0221-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.038

2015－03－31

萬山（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然產物研究，E-mail：m15311935803@163.com。

*通訊作者：王建中（1951-），男，碩士，教授，研究方向：林產品加工利用，E-mail：m15311935803@163.com。

林業公益性行業科研專項（201004081）。