一株產殼聚糖酶海洋真菌MF-08的分離鑒定及酶學性質研究

李佳茵，王慧敏，祖國仁

（大連工業大學生物工程學院，遼寧大連116034）

一株產殼聚糖酶海洋真菌MF-08的分離鑒定及酶學性質研究

李佳茵，王慧敏，祖國仁*

（大連工業大學生物工程學院，遼寧大連116034）

從實驗室保存的海洋產殼聚糖酶真菌中分離純化出一株產殼聚糖酶活性較高的菌株，命名為MF-08。通過26S rDNA序列分析并結合形態學鑒定，將海洋真菌MF-08歸為黃曲霉群。殼聚糖酶的最適作用溫度為40℃；最適反應pH為5.2；酶活在pH4.0～6.0和小于40℃范圍內相對穩定；Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋對殼聚糖酶活性有明顯的抑制作用。

海洋真菌MF-08，殼聚糖酶，26S rDNA

殼聚糖是甲殼素脫乙酰后的產物，是自然界中唯一天然存在的陽離子聚合物[1]。殼寡糖是殼聚糖的降解產物，是目前僅知的唯一的堿性寡糖，具有獨特的生物活性。由于殼寡糖與生物體細胞具有良好的生物兼容性，無毒性、環境友好型、易被生物體分解等許多特殊的理化性質，被廣泛地應用于多個領域。尤其是在醫藥和食品方面，殼寡糖具有提高食品質量和人體健康的重要功效。制備殼寡糖的方式主要有物理降解法、化學降解法和生物降解法（主要指酶法降解）[2]。殼聚糖酶是水解殼聚糖制備殼寡糖的專一性水解酶之一[3]。酶法降解易于控制過程和產物質量分布，且不造成環境的污染。為微生物工業化轉化殼聚糖提供理論基礎和實驗依據。目前已從多種微生物中分離出殼聚糖酶，大部分以細菌為出發菌，而且酶活相對并不是很高，殼聚糖酶實現商業化發展就比較困難。以從海洋中篩選分離出來的真菌為出發菌株的報道不是很多，提高其產殼聚糖酶的酶活性，為開發海洋資源提供重要依據。

本實驗研究一株從實驗室保存的海洋產殼聚糖酶真菌中分離純化出的產殼聚糖酶活性較高的菌株。通過形態學觀察及26S rDNA序列進行了初步鑒定。并對其產酶特性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海洋真菌MF-08 大連工業大學微生物實驗室分離保藏。

不銹鋼手提式蒸汽滅菌鍋 上海博訊儀器廠；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋、DGG-9070B型電熱恒溫鼓風干燥箱、MJP-150型霉菌培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；雙層小容量全溫度恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；722s分光光度計 上海精密儀器科學有限公司；TGL-16C型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 培養基

試管斜面培養基：1.0%葡萄糖，0.5%殼聚糖，0.2%蛋白胨，0.1%酵母膏，40%蒸餾水，60%陳海水，2%瓊脂，115～120℃，滅菌20 min，冷卻待用。

發酵培養基：碳源1.0%；酵母膏0.1%；蛋白胨0.5%；FePO40.01%；陳海水100 mL；pH7.6；在115～121℃滅菌20 min，冷卻待用。

平板分離培養基：1.0%膠體殼聚糖，0.5%蛋白胨，0.1%酵母膏，2%瓊脂，100 mL陳海水，115～120℃，滅菌20 min，冷卻待用。

改良的PDA培養基：將馬鈴薯洗凈，去皮，切成2 cm2的小塊備用。取20 g放入燒杯中，加入100 mL陳海水，煮沸30 min，用玻璃棒攪拌以防糊底。用雙層紗布過濾，取其濾液，補足海水，加入0.5%殼聚糖和1%蔗糖，在115～121℃滅菌20 min，冷卻待用。

1.3 實驗方法

1.3.1 粗酶液的制備 從保藏的試管斜面挑取孢子于液體發酵培養基中，37℃，振蕩培養72 h，取一定量發酵液，8000 r/min離心15 min，其上清液即為粗酶液[3]。

1.3.2 酶活力測定方法 1 mL含殼聚糖0.5%（0.5 g/100 mL）的乙酸緩沖液，加入1 mL粗酶液，37℃下保溫30 min，煮沸5 min終止酶反應[4]。DNS法測定還原糖[5]。

酶活性（U/mL）＝m×N×1000/（M×T×V）

其中：m：還原糖量（mg）；N：稀釋倍數；M：還原糖分子量（氨基葡萄糖C6H13O5N分子量）；T：反應時間（30 min）；V：酶液體積（1 mL）。

相對酶活：以同組實驗的最高酶活性值為1，其他酶活性與最高酶活的比值。

剩余酶活（%）：經過一定處理后此時的酶活/原來的酶活。

1.3.3 產殼聚糖酶菌株的分離純化 對本實驗室冷藏保存的20支菌種分別進行平板梯度稀釋，于27℃恒溫培養120 h，挑選生長情況較好的、有明顯透明圈的菌株。用平板分離培養基分離得到的活性較高的菌株，搖瓶發酵，用DNS法測酶活力，選取一株酶活力最高的菌株作為出發菌株[5]。將篩選出的菌株接入試管斜面培養基，冷藏保存。

1.3.4 海洋真菌MF-08的形態學鑒定 三點培養——菌落形態觀察：用滅菌牙簽沾取少量孢子在平板分離培養基上呈等邊三角形的點三個點，倒置于27℃的霉菌培養箱內，培養一定時間，觀察其逐漸變化。

小室培養——個體形態觀察：挑取少量海洋真菌MF-08的孢子于有馬鈴薯葡萄糖培養基的載玻片上，置于27℃霉菌培養箱中培養，24 h后于顯微鏡下觀察。

大培養——個體形態觀察：將生長有菌落的培養皿去除皿蓋置于顯微鏡的載物臺上，用低倍鏡觀察其生長情況。

制片觀察——菌落形態觀察：在干凈的載玻片上加一滴乳酸-苯酚固定液，用三棱針挑取已培養好的菌株MF-08置于其中，40倍光學顯微鏡下觀察[6]。

根據霉菌菌落及個體形態觀察，鑒定出霉菌菌屬。根據霉菌形態基本鑒定方法結合《食品衛生微生物檢驗標準手冊》[7]鑒定出霉菌菌種。

1.3.5 26S rDNA擴增與序列分析 26S rDNA的D1/D2區序列擴增的通用引物NL1：5’-GCATATCAATAAG CGGAGGAAAAG-3’；NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAA GACGG-3’進行擴增，PCR反應體系為50 μL：上述1的變形反應液1μL，PCR Premix 25μL，D1/D2 Forward primer（20pmol/μL）0.5 μL，D1/D2 Reverse primer（20pmol/μL）0.5 μL，dH2O 23μL。PCR過程：94℃，5 min；（94℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min）×30個循環；72℃，5 min。PCR產物進行檢測回收，并送交測序公司測序。

1.3.6 系統發育樹的構建 將所得序列與NCBI數據庫中的序列進行Blast比對，采用Mega 3.1軟件的鄰接法構建該海洋真菌的系統發育樹。

1.3.7 酶學性質的研究方法

1.3.7.1 最適反應溫度 將酶促反應體系的溫度分別設定為30、35、40、45、50、55、60、70、80℃，按照1.3.2的方法測酶活。

1.3.7.2 殼聚糖酶溫度穩定性 將殼聚糖酶的粗酶液分別置于30、40、45、50、60℃恒溫水浴鍋中保溫10、20、30、40、80、120 min，然后按照1.3.2的方法測剩余酶活力。

1.3.7.3 最適反應pH 用pH分別為4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6和5.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5%殼聚糖底物溶液代替酶活力測定中的pH5.4的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和0.5%殼聚糖底物溶液，按照1.3.2的方法測酶活。

1.3.7.4 殼聚糖酶pH穩定性 將粗酶液與不同pH的廣泛緩沖以1∶1體積比混合，在4℃下放置6 h，測剩余酶活。

1.3.7.5 金屬離子對殼聚糖酶活性的影響 分別向粗酶液加入5 mmol/mL Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋、Cu2＋、Zn2＋和Cu2＋，4℃靜置10 min后，測酶活。以不加金屬離子的酶液的酶活為參照。

1.3.8 方差分析數據處理方法 利用SPSS軟件對數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 產殼聚糖酶菌株的分離純化

將本實驗室保藏的海洋產真菌按照1.3.3中所述的方法進行分離純化，從中選取生長速度較快，酶活力最高是一株海洋真菌MF-08作為實驗的出發菌株。如圖1為海洋真菌MF-08在平板分離培養基上生長產生的菌落透明圈形態照片。

圖1 菌株的菌落和透明圈Fig.1 Strain colony with transparent cricle

2.2 海洋真菌MF-08的鑒定

2.2.1 海洋真菌MF-08的菌落形態觀察 用三點培養法將海洋真菌MF-08用滅菌牙簽接于平板分離培養基上，觀察其菌落形態變化見圖2。

圖2 MF-08的菌落形態Fig.2 The colony morph of MF-08 on plate

由圖2可知，菌落呈圓形酥松放射狀，扁平完整，無浸出液，無光澤。實驗發現顏色變化為：白點→變黃→變綠。

2.2.2 海洋真菌MF-08的個體形態觀察

2.2.2.1 小室培養 根據1.3.4中小室培養的方法進行培養并觀察，結果見圖3。

圖3 海洋霉菌N-8小室培養鏡下形態Fig.3 Microscopic morph of marine mold N-8 in cell culture inserts

2.2.2.2 制片觀察 根據1.3.4中制片觀察的方法進行培養并觀察，結果見圖4。

圖4 海洋霉菌N-8制片觀察鏡下形態Fig.5 Microscopic morph of marine mold N-8 on slide glass

2.2.2.3 大培養 根據1.3.4中大培養的方法進行培養并觀察，結果見圖5。

圖5 海洋霉菌N-8大培養鏡下形態Fig.5 Microscopic morph of marine mold N-8 on plate culture

2.2.3 海洋真菌MF-08的形態學鑒定 經過以上實驗，參照《食品衛生微生物檢驗標準手冊》[7]曲霉菌屬檢測表，發現分生孢子頭在發育過程中出現一些綠色，頂囊不是棒形，小梗單層或兩層。分生孢子頭幼期呈現鮮明的黃、綠色，有時老后變成褐色，酥松放射狀，全部頂囊著生小梗，小梗雙層。所以初步鑒定為海洋真菌MF-08群。

2.2.4 26S rDNA擴增與序列分析 菌株MF-08的PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖6。

圖6 海洋真菌MF-08的26S rDNA 3%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.6 3%agarose gel electrophoresis analysis of 26S rDNA

擴增產物片段的大小為594 bp，將所得序列與NCBI數據庫中的序列進行Blast（Basic Local Alignment Search Tool）比對，結果發現該海洋真菌MF-08的26S rDNA部分序列與曲霉屬（Aspergillus sp.）的26S rDNA序列同源性達100%，由此可知，該海洋產殼聚糖酶真菌為曲霉屬。

2.2.5 系統發育樹的構建 采用Mega 3.1軟件的鄰接法構建海洋真菌MF-08的系統發育樹，見圖7。

如圖7可知，海洋真菌MF-08與Aspergillus flavus（EF661564.1）和Aspergillus flavus（EF661566.1）聚在一起。故海洋真菌FM-08屬于黃曲霉群（Aspergillus flavus）。

綜合2.2.3的形態學鑒定和海洋真菌MF-08的26S rDNA序列同源性比較結果可知，海洋真菌MF-08為黃曲霉群（Aspergillus flavus）。

2.3 殼聚糖酶部分酶學性質研究

2.3.1 殼聚糖酶反應的最適溫度 在不同溫度下測定海洋真菌MF-08產殼聚糖酶的活力，結果見圖8。

溫度是影響酶活性和穩定性的重要因素，該殼聚糖酶的最適反應溫度和溫度穩定性是判斷其應用價值的重要考察指標。從圖8可以看出，反應溫度在40℃以下時，殼聚糖酶活力隨著溫度的升高而增加，40℃時酶活性最高，反應溫度高于40℃后，酶活力隨之降低。所以最適反應溫度為40℃，與Katsuaki Hirano[8]研究結果相近。而王艷君[9]、閻賀靜等[10]所研究菌株的殼聚糖酶的最適溫度為55℃，袁建平等[11]所研究的為45℃。

圖7 海洋真菌MF-08與相關菌株序列的26S rDNA基因序列的鄰接法系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree showing the relationships of marine fungus MF-08 with the sequence of relating type genera constructed by the neighour-joining method and based on 26S rDNA gene sequences

圖8 溫度對殼聚糖酶活性的影響Fig.8 Effect of temperature on chitosanase activity

2.3.2 溫度對殼聚糖穩定性的影響 殼聚糖酶在不同溫度下保溫10 min后，測得的剩余酶活見圖9。

圖9 溫度對殼聚糖穩定性的影響Fig.9 Effect of temperature on the stability of chitosanase

如圖9可知，在45℃以下，剩余酶活力可保持85%以上，當溫度高于50℃時，酶活力急劇下降，55℃保溫10 min后，剩余酶活力為50%，60℃以上保溫10 min后，酶活力基本完全喪失。

該殼聚糖酶在30、40、50、60℃下放置不同時間后測得的剩余酶活力見圖10。

圖10 不同溫度下殼聚糖酶在不同時間內的對熱穩定性Fig.10 Effect of time on the stability of chitosanase under different temperature

從圖10可知，40℃下隨放置時間的延長，酶活力有一定的損失，60 min后剩余酶活力為70%，而30℃下放置的酶活力基本穩定。MF-08菌株的殼聚糖酶在較低溫度條件下穩定性較高，具有一定的工業應用價值。

2.3.3 殼聚糖酶的最適反應pH pH會影響酶的構象，以及底物和酶分子活性部位有關基團的解離狀態，影響酶的催化活性。因此酶的最適pH及其pH穩定性是酶應用價值的重要考察指標。由圖11中可以看出，該殼聚糖酶的最適反應pH為5.2。與趙玉萍等[12]的研究結果基本相似。MF-08菌株所產殼聚糖酶具有較寬的pH范圍，pH在4.4～5.8范圍內相對酶活性仍能保持在0.8 U/mL以上。

圖11 pH對殼聚糖酶活性的影響Fig.11 Effect of pH on chitosanase activity

2.3.4 pH對殼聚糖穩定性的影響 從圖12可以看出，殼聚糖酶在pH4.0～6.0之間活力相對穩定，在此區間范圍內，4℃下放置6 h后，殼聚糖酶的剩余酶活力仍能保持在原來的25%～30%。

2.3.5 金屬離子對殼聚糖酶活性的影響 由圖13可以看出，Mg2＋、Ca2＋、Zn2＋和Na＋對殼聚糖酶活力的影響都不是很明顯。Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋則會對殼聚糖酶活性具有很明顯的抑制作用，尤其是Hg2＋。這和楊立紅[13]和Anh Dzung Nguyen[14]的研究結果基本一致。原因在于殼聚糖與重金屬離子的螯合作用，從而干擾殼聚糖酶對底物的降解，導致酶活性降低。

圖12 pH對殼聚糖酶穩定性的影響Fig.12 Effect of pH on the stability of chitosanase

圖13 屬離子對殼聚糖酶活性的影響Fig.13 Effect of metal ions on chitosanase activity

3 結論

3.1 從實驗室保存的20支產殼聚糖酶的菌種中分離純化出一株產殼聚糖酶活力較高并能穩定遺傳的海洋真菌MF-08作為出發菌株。

3.2 對菌株MF-08進行了形態學鑒定和26S rDNA序列比對分析，確定海洋真菌MF-08為黃曲霉群（Aspergillus flavus）。

3.3 海洋真菌MF-08部分酶學性質的研究表明：殼聚糖酶的最適作用溫度和最適反應pH分別為40℃和pH5.2，酶活在pH4.0～6.0和小于40℃范圍內相對穩定；Mg2＋、Ca2＋、Zn2＋和Na＋對殼聚糖酶活力的影響都不是很明顯，Cu2＋、Fe3＋和Hg2＋則會對殼聚糖酶活性具有很明顯的抑制作用，尤其是Hg2＋。

[1]王艷君，陳盛，楊謙，等.產殼聚糖酶菌株的分離、鑒定及發酵條件優化[J].生物學雜志，2012，29（6）：39-43.

[2]朱利平，黃惠莉.產殼聚糖酶海洋真菌鑒定、寡營養培養基優化及廉價培養基研究[J].食品與發酵工業，2011，37（5）：35-39.

[3]王艷君，廖春林.產殼聚糖酶菌株的單因素及復合條件誘變育種[J].河南城建學院學報，2012，21（4）：24-31.

[4]宋曉晨.海洋微生物殼聚糖酶菌株篩選及培養條件[D].大連：大連工業大學，2010.

[5]李風平，何瀟，鮑曉明.殼聚糖酶產生菌的篩選及酶解產物的初步研究[J].山東大學學報，2003，38（1）：96-102.

[6]袁道強，黃建華.生物化學實驗和技術[M].北京：中國輕工業出版社，2006.

[7]羅雪云，劉宏道，周桂蓮，等.食品衛生微生物檢驗標準手冊[M].北京：中國標準出版社，1995：243.

[8]Katsuaki Hirano，Sitthinan Arayaveerasid，Kiyohiko Seki. Characterization of a Chitosanase from Aspergillus fumigatus ATCC13073[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2012，76（8）：1523-1528.

[9]王艷君，卓少玲，陳盛，等.產殼聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶學特性分析[J].微生物學通報，2012，39（12）：1734-1745.

[10]閻賀靜，周念波，涂邵勇，等.殼聚糖酶生產菌篩選、鑒定及其酶學性質[J].廣東農業科學，2012（24）：161-164.

[11]袁建平，侯曉強.殼聚糖酶的分離純化及性質研究[J].湖北農業科學，2013，52（15）：3647-3649.

[12]趙玉萍，錢紅梅.綠色木霉產殼聚糖酶的分離純化及酶學性質[J].中國糧油學報，2009，24（4）：144-147.

[13]楊立紅，程仕偉，馮志彬，等.鏈霉菌殼聚糖酶的純化及其酶學性質[J].生物加工過程，2013，11（3）：52-58.

[14]Anh Dzung Nguyen，Chun-Ching Huang，Tzu-Wen Liang. Production and purification ofa fungalchitosanase and chitooligomers from Penicilliumjanthinellum D4 and discovery of the enzyme activators[J].Carbohydrate Polymers：Scientific and Technological Aspects of Industrially Important Polysaccharides，2014，108：331-337.

Isolation，identification and enzyme characteristics of the chitosanase producing marine fungal MF-08

LI Jia-yin，WANG Hui-min，ZU Guo-ren*
（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Isolated and purified a high enzyme activity strain from the chitosanase producing Marine fungi which preservation in laboratory，it was named MF-08.Based on the 26S rDNA sequence analysis and morphological properties，Marine fungi MF-08 was assessed to be Aspergillus flavus.The optimum temperature of chitosanase was 40℃，the optimum pH was 5.2，the chitosanase was stable below 40℃ and pH4.0～6.0，respectively.The enzyme activity was inhibited by Cu2+，Fe3+and Hg2+.

marine fungal；chitosanase；26S rDNA

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0193-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.032

2015－03－09

李佳茵（1990-），女，碩士研究生，研究方向：微生物生物活性物質，E-mail：m15140402799@163.com。

*通訊作者：祖國仁（1963-），男，教授，研究方向：微生物生物活性物質，E-mail：rgz321@163.com。