銀杏葉多糖分離純化、結構鑒定及抗氧化活性研究

何 鋼，劉 嵬，李會萍，梁 立，郭曉強，顏 軍，茍小軍

（成都大學藥食同源植物資源開發高校重點實驗室，四川成都610106）

銀杏葉多糖分離純化、結構鑒定及抗氧化活性研究

何 鋼，劉 嵬，李會萍，梁 立，郭曉強，顏 軍，茍小軍*

（成都大學藥食同源植物資源開發高校重點實驗室，四川成都610106）

目的：分離純化銀杏葉多糖（GBLP）并對其結構進行表征及抗氧化活性研究。方法：超聲輔助提取制備銀杏葉粗多糖，經精制除雜和陰離子交換柱分離獲得多糖級分，采用高效凝膠過濾色譜（HPGFC）、氣相色譜法（GC）分析相對分子質量和單糖組成；采用體外抗氧化方法評價銀杏葉多糖抗氧化活性。結果：GBLP經分離后獲得三個級分GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ，其相對分子質量（Mw）分別為41861、361352、637533。GBLPⅠ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成；GBLPⅡ和GBLPⅢ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖組成，但其摩爾比不同。體外抗氧化實驗表明GBLPⅢ對羥自由基的清除能力最強，其次為GBLPⅡ、GBLPⅠ、GBLP；而GBLPⅡ和GBLPⅢ對超氧陰離子清除能力相對較好，其次為GBLPⅠ、GBLP。結論：銀杏葉多糖各級分的單糖組成比例、相對分子質量有差異；對羥自由基的清除作用強于對超氧陰離子的清除作用，對羥自由基的清除作用差異可能與Mw及結構相關。

銀杏葉多糖，分離純化，相對分子質量，單糖組成，抗氧化

銀杏（Ginkgo biloba）是裸子植物門、銀杏科、銀杏屬單種植物，有近2億年的歷史，被稱為“活化石”。銀杏種子和葉具有重要的藥用價值。銀杏種子含有抗氧化活性和保護DNA受損傷的蛋白質[1]。銀杏葉提取物具有活血、止咳、擴張冠狀動脈血管、降低血膽固醇、抗抑郁等多種功效，其相關藥品已經用于臨床治療。銀杏葉主要化學成分有萜類、多酚類、烷基酚、黃酮及黃酮甙類、萜內酯類、多糖類化合物[2-6]。多糖是由多個單糖或單糖衍生物聚合而成的大分子化合物，具有諸多藥理活性，銀杏外種皮多糖的單糖組成、相對分子質量、結構特點以及抗氧化和抗腫瘤活性已有文獻報道[7-9]，為其開發利用打下基礎。近年來的研究表明銀杏葉多糖也具有潛在的藥用價值和醫藥開發價值。研究表明銀杏葉多糖具有調節免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、抗衰老等多種功效[10-13]。而對銀杏葉多糖的結構研究還不夠深入，多糖一級結構特征、空間結構和構效關系研究較少。目前對銀杏葉多糖的種類、單糖組成和相對分子質量已有報道，但是各實驗室的研究結果存在一定的差異，因此對銀杏葉多糖深入研究具有重要的意義。在前人的研究基礎上以秋季采收的銀杏葉為材料制備銀杏葉多糖，并對其進行分離純化，檢測其單糖組成、相對分子質量和體外抗氧化活性，為銀杏葉多糖的結構研究和資源利用做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏葉 9月中旬采自成都大學校園；鼠李糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、維生素C、濃硫酸、苯酚、氫氧化鈉、氯化鈉、Tris堿、水楊酸、硫酸亞鐵、鄰苯三酚、正丁醇、三氯甲烷、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、甲醇、乙酸酐、濃鹽酸、無水乙醇、過氧化氫 分析純，成都科龍化學試劑公司；標準葡聚糖（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000） 購自Solarbio公司。

UP-500純水儀 成都優普科學儀器公司；DL-6M高速冷凍離心機 湖南湘儀儀器公司；CT15RT臺式高速冷凍離心機 上海天美儀器公司；UV-2802紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器公司；KQ-400KDE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司；凍干機 美國Labconco儀器公司；AKTA prime plus蛋白質層析系統 美國通用儀器公司；RE-2000、RE-5210A旋轉蒸發器 上海亞榮儀器公司；GC-2010氣相色譜儀 日本島津儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏葉多糖的制備

1.2.1.1 銀杏葉粗多糖的制備 銀杏葉經60℃烘干后粉碎，銀杏葉粉用石油醚（沸程60～90℃）蒸餾回流2次，每次2.5 h。濾渣置于托盤中揮走石油醚后備用，稱取1 kg脫脂處理的銀杏葉粉參照文獻[7，10]方法，采用溫度80℃，料液比1∶50，超聲提取時間10 min，超聲功率400 W，提取三次合并提取液，提取液經6000 r/min離心15 min，90℃條件下旋轉蒸發儀減壓濃縮至4 L，加入4倍體積的無水乙醇過夜沉淀多糖，多糖沉淀10000 r/min離心10 min獲得粗多糖。采用硫酸-苯酚法[14]測定銀杏葉粗多糖提取液中多糖含量，多糖提取得率（%）=（溶液中多糖濃度×提取液總體積）/銀杏葉總質量×100。

1.2.1.2 銀杏葉多糖的精制 取適量銀杏葉粗多糖加蒸餾水復溶，采用Sevag試劑法[9]清除多糖溶液中的蛋白質和核酸等雜質，采用UV光譜儀分析精制多糖溶液，波長掃描范圍200～600 nm，除雜多糖溶液在254 nm和280 nm檢測無吸收峰為止。除雜多糖溶液按5∶1（mL/g）同D101大孔樹脂混合，攪拌均勻，靜態吸附色素4～5 h后，多糖溶液連同柱料一起裝柱，收集流出液即為脫色多糖溶液。多糖溶液再經透析（透析袋截留分子量8000～14000）去除小分子化合物，袋內溶液經真空冷凍干燥后得到精制多糖。

1.2.2 銀杏葉精制多糖的分離純化 稱取0.5 g精制銀杏葉多糖（GBLP），加入10 mL蒸餾水充分溶解后10000 r/min離心10 min，上清液用陰離子交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow進行分離，以1 mL/min流速進行洗脫。先用蒸餾水洗脫100 mL，然后用0～1.0 mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫150 mL，最后再用1.0 mol/L NaCl溶液洗脫50 mL。每支試管收集3 mL。收集液用硫酸-苯酚法測定A490nm值[14]，以試管編號為橫坐標，A490nm值為縱坐標繪制洗脫曲線。

1.2.3 銀杏葉多糖級分相對分子質量測定 銀杏葉多糖級分相對分子質量的測定采用高效凝膠過濾色譜法[15]（HPGFC）。色譜條件：色譜柱型號YMC Pack-Diol 200（300 mm×8.0 mm，5 μm，200 ?），流動相為超純水，流速0.8 mL/min，柱溫35℃，檢測器為示差折光檢測器（RI），進樣量20 μL。

1.2.3.1 標準曲線的制作 以葡萄糖（Glc）及標準葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000為標準品，分別用超純水溶解配制成2 mg/mL溶液進樣，記錄洗脫峰的保留時間。葡萄糖標液進樣測得Vt，T-2000標液測得外水體積V0。分別用T-500、T-70、T-40、T-10的標準溶液相繼進樣，分別求得它們的洗脫體積Ve。相對分子質量Mw與其在凝膠柱上的洗脫體積Ve、分配系數Kav存在如下關系：

Ve=a-blnMw

Kav=K1-K2lnMw

Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0）

式中：a、b、K1、K2為常數。

以Kav對lnMw進行線性回歸處理，得線性回歸方程。

1.2.3.2 樣品相對分子質量的測定 分別取銀杏葉多糖各級分配制成2 mg/mL的溶液，按上述條件進行色譜分析，記錄樣品保留時間。由樣品保留時間計算該銀杏葉多糖級分在凝膠柱上的洗脫體積Ve，從而獲得分配系數Kav，制作的回歸方程即可得該銀杏葉多糖級分的相對分子質量Mw。

1.2.4 紅外光譜分析 銀杏葉多糖各級分經凍干后分別用KBr研磨均勻，壓片后進行紅外光譜分析，掃描范圍為400～4000 cm-1。

1.2.5 糖腈衍生化分析銀杏葉各級分單糖組成

1.2.5.1 氣相色譜條件 色譜柱：FFAP毛細管柱，長為30 m，膜厚為0.25 μm，內徑為0.25 mm。載氣：氮氣，控制方式：線速度，壓力：144.4 kPa，總流量：6.9 mL/min，柱流量：1.29 mL/min，線速度：36.7 cm/s，吹掃流量：3.0 mL/min，分流比：2∶1。程序升溫：初始柱溫170℃，保持2 min；然后以4℃·min-1的升溫速率升至187℃；再以0.5℃·min-1的升溫速率升至188℃，保持1 min；以1℃·min-1的升溫速率升到196℃，保持2 min；以4℃·min-1的升溫速率升到208℃，保持1 min；以0.5℃·min-1的升溫速率升至209℃，保持3 min。

1.2.5.2 混合單糖溶液配制 精確稱取內標化合物山梨醇10.0 mg于25 mL容量瓶中用無水吡啶溶解并定容至刻度。精確稱取單糖標準品（果糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖）各100.0 mg于25 mL容量瓶中，用無水吡啶溶解并定容至刻度。并用無水吡啶對混合單糖溶液進行2倍稀釋。

1.2.5.3 銀杏葉多糖的水解樣品制備 準確稱取多糖樣品10.0 mg于安培瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸（TFA）2 mL，充N2封管，于110℃烘箱中水解6 h，水解液10000 r/min離心5 min，取上清液于西林瓶中，加適量甲醇，蒸干備用，待衍生化時用1 mL無水吡啶復溶。

1.2.5.4 糖腈衍生化 分別取上述梯度稀釋的混合單糖溶液和多糖水解溶液1 mL于具塞試管中，再分別準確加入1 mL內標溶液和1 mL鹽酸羥胺溶液（15 mg/mL），混勻后封管，在80℃水浴中反應30 min；反應后冷卻至室溫，分別加入0.8 mL乙酸酐溶液，封管后于70℃水浴中乙酰化反應30 min，反應結束后將反應溶液移入西林瓶中，水浴鍋蒸干后用1 mL氯仿溶解，然后進行氣相色譜分析。

1.2.6 銀杏葉多糖抗氧化活性的測定

1.2.6.1 清除羥基自由基（·OH-）的活性測定 向試管中加入一系列不同濃度多糖溶液1.0 mL，FeSO4溶液（1.8 mmol/mL）2.0 mL，水楊酸-乙醇（1.8 mmol/mL）1.5 mL，最后加濃度為0.3%的H2O2溶液0.1 mL啟動反應，振蕩混合，37℃水浴保溫30 min，在波長510 nm下測量各自的吸光度值。以1.0 mL蒸餾水代替多糖溶液，其余操作同上作為空白，VC作陽性對照[16]。

羥基自由基清除率計算公式為：

清除率（%）=[（A0－AS）/A0]×100

式中，A0為空白管的吸光度，AS為樣品的吸光度。IC50值的計算，以多糖溶液濃度為橫坐標，清除率為縱坐標作圖并進行回歸分析，清除率為50%時所對應的多糖濃度即為IC50值。

1.2.6.2 對超氧陰離子（·O2-）的清除作用 0.1 mL不同濃度的多糖溶液，加入5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2），25℃水浴10 min，加入0.2 mL 6 mmol/L的鄰苯三酚溶液，搖勻后每隔30 s在325 nm處測定吸光度值，4 min內測量完成。以0.1 mL水代替多糖溶液，0.2 mL水代替鄰苯三酚作參比液，0.1 mL水代替多糖溶液作對照溶液，其余同上述方法操作，VC作陽性對照[16]。

清除率（%）=（1－樣品斜率/對照斜率）×100

式中，斜率指以間隔時間為橫坐標，相應吸光度值為縱坐標進行線性回歸分析，所得回歸方程的斜率。IC50值的計算，以多糖溶液濃度為橫坐標，清除率為縱坐標作圖并進行回歸分析，清除率為50%時所對應的多糖濃度即為IC50值。

1.3 數據處理及分析

各組數據以X±SD表示，數據處理采用Excel軟件分析。

2 實驗結果

2.1 銀杏葉多糖的精制

銀杏葉多糖提取液經硫酸苯酚法測得A490nm值代入葡萄糖標準曲線y=2.6771x－0.0136，R2=0.9981，計算銀杏葉粗多糖提取得率為6.87%。多糖溶液經Saveg試劑除雜處理和大孔樹脂脫色處理后的紫外光譜分析如圖1，由圖1可知254 nm和280 nm處無吸收峰，表明多糖中蛋白質和核酸等雜質已去除，多糖得到精制。

圖1 精制銀杏葉多糖溶液紫外光譜圖Fig.1 UV spectrum of purifed G.biloba leaf polysaccharides

2.2 精制銀杏葉多糖的分離純化

精制的GBLP經DEAE-Sepharose Fast Flow柱分離結果如圖2，由圖2可知GBLP經分離后獲得三個級分，分別命名為GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ。

圖2 GBLP的洗脫曲線Fig.2 GBLP elution curves

2.3 銀杏葉多糖相對分子質量

系列標準葡聚糖T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000的保留時間見表1，以分配系數Kav為橫坐標，相對分子質量的對數為縱坐標作圖，并通過回歸處理得線性回歸方程為y=－9.1239x＋14.254，R2=0.9969（圖3）。

表1 標準樣品的HPGFC保留時間Table 1 HPGFC retention time of standard sample

圖3 相對分子質量標準曲線Fig.3 Relative molecular mass standard curve

利用高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）將銀杏葉多糖分離后的各級分樣品在相同色譜條件下進樣分析，并記錄GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ色譜峰的保留時間，通過線性回歸方程，計算GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ的相對分子質量（Mw）分別為41861、361352、637533。

2.4 銀杏葉多糖級分紅外光譜分析

各多糖級分紅外光譜檢測結果如圖4所示。在3409 cm-1附近出現一個寬峰，是多糖特征的O-H的伸縮振動峰，表明多糖存在分子內和分子間的氫鍵；2915 cm-1附近弱吸收峰為飽和的C-H伸縮振動峰；1623 cm-1附近的吸收峰為C=O伸縮振動峰，1424、1384 cm-1附近的吸收峰為=CH2的變形吸收峰。在（950～700 cm-1）864 cm-1處具有吸收峰，表明銀杏葉多糖含有甘露糖。由紅外圖譜可知GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ具有明顯的糖類化合物的特征。

圖4 銀杏葉多糖紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of Ginkgo biloba leaf polysaccharides

2.5 銀杏葉多糖的單糖組成分析

2.5.1 混合單糖糖腈衍生化產物法標準曲線 混合單糖標準品溶液和銀杏葉精制多糖水解產物進行糖腈衍生化后經GC分析，以峰面積為縱坐標，每種單糖進樣前濃度與校正因子的積為橫坐標進行線性回歸，計算回歸方程、相關系數。由圖5可以看出各單糖及內標化合物在該色譜條件下分離度好，由表2結果可知各單糖線性關系良好。

圖5 混合單糖氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatography of mixture of standard monosaccharides

表2 單糖標準品衍生物的標準曲線Table 2 Standard curve of standard monosaccharides derivatization

圖6 銀杏葉多糖各級分的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatography of Ginkgo biloba leaf polysaccharide components

2.5.2 銀杏葉多糖各分離級分的單糖組成 銀杏葉多糖分離后的三個級分GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ分別經水解，糖腈衍生化后進行GC分析并記錄各單糖峰面積，結果如圖6。GBLPⅠ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其摩爾比為：1∶3.5∶18.2∶7.4∶7.5；GBLPⅡ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖組成，其摩爾比為：1.5∶1.6∶1∶2.2；GBLPⅢ由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖組成，其摩爾比為：1.6∶1∶1.1∶1.7。

2.6 銀杏葉多糖活性的測定

2.6.1 對羥基自由基的清除作用 銀杏葉精制多糖（GBLP）及GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ對羥自由基的清除作用結果如圖7所示。由圖7可知，當VC濃度達0.5 mg/mL時其對羥基自由基清除率達93.28%，清除作用強于銀杏葉多糖。銀杏葉多糖級分濃度增加清除率增大，GBLPⅢ清除作用強于GBLPⅡ、GBLPⅠ、GBLP，對羥自由基清除率的IC50值分別為0.96、2.10、3.23、3.67 mg/mL。同時也表明銀杏葉多糖分離后的各級分對羥基自由基清除活性高于分離前的混合多糖。

圖7 銀杏葉多糖對·OH的清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of GBLP

2.6.2 對超氧陰離子的清除作用 銀杏葉精制多糖（GBLP）及GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ對超氧陰離子的清除作用結果如圖8所示。同陽性對照VC相比較，銀杏葉多糖對超氧陰離子的清除作用較差，當樣品濃度為6 mg/mL時VC對超氧陰離子的清除率達99.70%，而GBLP為6.96%，GBLPⅠ為7.42%，GBLPⅡ為9.39%，GBLPⅢ為9.00%。在濃度為0.5～6 mg/mL范圍內GBLPⅡ和GBLPⅢ對超氧陰離子的清除活性較GBLPⅠ和GBLP高。

圖8 銀杏葉多糖對超氧陰離子的清除率Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activity of GBLP

3 結論

銀杏葉粗多糖經陰離子交換柱分離純化獲得三個級分GBLPⅠ、GBLPⅡ、GBLPⅢ，通過高效凝膠色譜法分析其相對分子質量（Mw）分別為41861、361352、 637533。單糖組成分析和紅外光譜數據表明GBLPⅠ可能是以甘露糖為主鏈組成的雜多糖，而GBLPⅡ和GBLPⅢ可能是以半乳糖為主鏈組成的雜多糖。單糖組成的研究結果同靳菊情[17]、Josefkraus[18]、楊靜峰等[19]報道較一致，而相對分子質量結果有一定差別，可能與測定的方法有關。同VC相比較，銀杏葉多糖對羥基自由基和超氧陰離子的清除作用較弱，但是GBLPⅢ對羥基自由基的清除作用強于GBLPⅡ、GBLPⅠ以及GBLP，表明分離后銀杏葉多糖級分對羥基自由基清除活性提高。而銀杏葉多糖對超氧陰離子的清除作用較弱，GBLPⅡ和GBLPⅢ對超氧陰離子的清除作用強于GBLPⅠ和GBLP。研究結果也表明在一定的濃度范圍內銀杏葉多糖對羥基自由基和超氧陰離子的清除作用具有明顯的劑量效應。銀杏葉多糖各級分之間的單糖組成比例、相對分子質量存在明顯差異，同時對羥自由基的清除作用也存在差異，這可能與Mw及結構相關。

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Isolation and purification，structure identification and antioxidant activity of polysaccharides of Ginkgo biloba leaf

HE Gang，LIU wei，LI Hui-ping，LANG Li，GUO Xiao-qiang，YAN Jun，GOU Xiao-jun*
（Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Department，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

Objective：Isolation and purified the polysaccharide from Ginkgo biloba leaf and investigated its structure characterization，antioxidant activity.Method：Extract polysaccharide from G.biloba leaf by ultrasonic assisted，crud polysaccharide was refined and then was isolated by anion exchange column，the relative molecular weight was measured by gel column chromatography，the monosaccharide composition was analyzed by GC，by adopting the method of in vitro antioxidant evaluation of G.biloba leaf polysaccharide antioxidant activity. Result：G.biloba leaf polysaccharide was purified and got three ingredients named GBLPⅠ，GBLPⅡand GBLPⅢ.The relative molecular weight（Mw）was 41861，361352，637533 respectively.GBLPⅠwas consisted of rhamnose，arabia，mannose，glucose，galactose composition.GBLPⅡ and GBLPⅢ were consisted of rhamnose，arabia，mannose，galactose composition，but and the molar ratio was different.The result of antioxidant experiment in vitro showed that the ability of GBLPⅢ scavenging on hydroxyl free radical was strongest，followed by GBLPⅡ，GBLPⅠ，GBLP.While the ability of GBLPⅡand GBLPⅢscavenging on superoxide anion was relatively good，followed by GBLP，GBLPⅠ.Conclusion：The monosaccharide composition and relative molecular mass of the fractions isolated from G.biloba leaf crude polysaccharide was difference.The ability of G.biloba leaf polysaccharide on hydroxyl free radical scavenging was stronger than the scavenging on superoxide anion，the hydroxyl free radical scavenging effect difference might be associated with Mw and structure.

Ginkgo biloba leaf polysaccharide；isolation and purification；relative molecular mass；monosaccharide composition；antioxidant

TS201.2

A

1002-0306（2015）22-0081-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.008

2015－03－17

何鋼（1982-），男，博士，講師，研究方向：糖生物化學，E-mail：hegang@cdu.edu.cn。

*通訊作者：茍小軍（1974-），男，博士，教授，研究方向：糖生物化學，E-mail：jmee@cdu.edu.cn。

四川省科技廳應用基礎計劃項目（2015JY0117）；四川省教育廳項目（14ZB0374）；四川省中醫藥管理局項目（2014G001）。