人巨細胞病毒在乳汁中的載量變化及其傳播風險

王婷 崔會玲 段歌紅 陳茂才 冀恒濤

鄭州大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，河南鄭州450014

人巨細胞病毒在乳汁中的載量變化及其傳播風險

王婷 崔會玲 段歌紅 陳茂才 冀恒濤

鄭州大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，河南鄭州450014

目的探討人巨細胞病毒（HCMV）DNA在乳汁中的載量變化以揭示其通過母乳喂養(yǎng)將病毒傳播給嬰兒的風險。方法選擇2013年9月～2014年10月于鄭州大學第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科住：的305名產(chǎn)婦（哺乳期母親）及其嬰兒作為實驗對象，選擇同期103名奶粉喂養(yǎng)嬰兒為對照，用實時熒光定量PCR方法檢測其乳汁、尿液和外周血白細胞中的HCMV病毒DNA載量，數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析比較各組差異。結(jié)果產(chǎn)后第6周乳汁病毒DNA總陽性率為44.92%，其中有73名母親將病毒傳播給了嬰兒，72名是非傳播者。傳播者的DNA載量為（4.70±1.26）（lg）而非傳播者為（3.08±0.88）（lg），差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。病毒DNA陽性乳汁喂養(yǎng)的嬰兒感染率（50.68%）顯著高于陰性乳汁喂養(yǎng)的嬰兒（3.70%）和奶粉喂養(yǎng)的嬰兒（9.71%），差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而且母乳喂養(yǎng)及奶粉喂養(yǎng)的早產(chǎn)兒的尿液HCMV-DNA陽性率（83.33%、37.50%）均高于足月兒（47.76%、7.37%），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。乳汁病毒DNA載量高于3.42者，84%將病毒傳播給嬰兒，而低于3.42者75%沒有傳播病。因此，2600 copies/mL（lg2600=3.42）為傳播者的臨界值。結(jié)論含有病毒的乳汁是HCMV的重要傳染源，而且建議乳汁HCMV DNA載量2600 copies/mL作為傳播者的臨界值。早產(chǎn)兒對HCMV更為易感，尿液病毒DNA檢測用來診斷HCMV具有很好的敏感性。

人巨細胞病毒曰母嬰傳播曰乳汁曰病毒DNA

人巨細胞病毒（HCMV）屬于β-皰疹病毒，即人皰疹病毒-5型，是先天性病毒感染的最主要原因，也是引起人類出生缺陷的主要病原體[1]。但只有10%的先天性HCMV感染表現(xiàn)出臨床癥狀，有癥狀的新生兒中5%～17%會發(fā)生神經(jīng)損傷或聽力、視力損傷[2]。如果在孕期HCMV復發(fā)感染，母親有1%的概率將病毒傳播給胎兒，而原發(fā)感染的孕婦有40%會發(fā)生母嬰傳播[3]。圍生期HCMV感染的傳播途徑有胎盤、產(chǎn)道、母乳喂養(yǎng)和親密接觸等[4]。哺乳期婦女會發(fā)生HCMV復發(fā)并將病毒排入乳汁成為重要的傳播途徑[5]。原發(fā)感染、復發(fā)感染和持續(xù)性感染期間HCMV DNA可以從多種體液中分離純化，如尿液、唾液、羊水、血液、淚液、宮頸陰道分泌物、乳汁、精液等[6-8]。本研究對母親乳汁和嬰兒尿液及外周血白細胞中DNA載量進行定量檢測以評價乳汁對于HCMV母嬰傳播的影響。

1 對象與方法

1.1 對象

選擇2013年9月～2014年10月在鄭州大學第二附屬醫(yī)院出生的308名母乳喂養(yǎng)的嬰兒及其母親，其中男160名，女148名；早產(chǎn)兒22名，足月兒286名，包含3對雙胞胎。選擇同期奶粉喂養(yǎng)的嬰兒103名（男54名，女49名；早產(chǎn)兒8名和足月兒95名）。305名哺乳母親在孕期優(yōu)生篩查時，HCMV IgG均為陽性，年齡19～41歲，平均（28.9±3.4）歲；出生時孕齡31～42周，平均（38.4±6.3）周；嬰兒出生體重1910～4665 g；平均（3389±121）g。出生時孕齡＜37周為早產(chǎn)兒。

1.2 儀器與試劑

PCR擴增儀LightCycler1.5（曼海姆）購自德國羅氏診斷有限公司。離心機（水平轉(zhuǎn)子）購自北京白洋醫(yī)療器械有限公司。人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司。人外周血淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集與處理每個患者抽取1 mL EDTA抗凝血，經(jīng)1mL無菌生理鹽水倍比稀釋后緩緩加入至淋巴細胞分離液中，用密度梯度離心法，1500 r/min離心20 min，分離收集外周血單核細胞（PBMC）。＜3 mL尿液收集至無菌試管，12 000 r/min離心5 min，保留沉淀備用。＜3 mL乳汁收集至無菌試管，1500 r/min離心15 min，棄去上層脂肪層和底層細胞層，吸取中間乳清層再次離心，12 000 r/min離心5 min，保留沉淀備用[9]。

1.3.2 HCMV-DNA定量檢測尿液、乳汁和PBMC中病毒DNA的提取和檢測，利用PCR擴增儀LightCycler1.5和HCMC核酸定量檢測試劑盒，按照說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件（國際商業(yè)機器公司，美國紐＜）進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗和四格表精確檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 出生6周內(nèi)母親和嬰兒各標本中HCMV DNA陽性率的變化

乳汁HCMV DNA陽性率前6周持續(xù)升高，母乳喂養(yǎng)嬰兒和奶粉喂養(yǎng)嬰兒的尿液DNA陽性率均顯著高于PBMC（P＜0.05）。母乳喂養(yǎng)嬰兒與奶粉喂養(yǎng)嬰兒尿液DNA陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 產(chǎn)后6周母親乳汁和嬰兒PBMC及尿液HCMV DNA陽性率變化（%）

2.2 早產(chǎn)兒和足月兒各種喂養(yǎng)方法的HCMV DNA陽性率

病毒DNA陽性母乳喂養(yǎng)嬰兒的尿液DNA總陽性率顯著高于陰性母乳喂養(yǎng)和奶粉喂養(yǎng)的嬰兒（P＜0.01）。而且早產(chǎn)兒尿液HCMV DNA總陽性率高于足月兒（P＜0.05）。見表2。

2.3 產(chǎn)后8周HCMV在乳汁中DNA載量的變化

病毒傳播者與非傳播者母親乳汁中病毒DNA載量的變化趨勢相似，前6周逐漸升高，第8周開始下降，見圖1；但前者的DNA載量（4.70±1.26）（lg）顯著高于后者（3.08±0.88）（lg），差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。乳汁病毒DNA載量高于3.42者，84%將病毒傳播給嬰兒；而低于3.42者75%沒有傳播病毒。鑒于該載量差異，建議2600 copies/mL（lg2600=3.42）作為傳播者的臨界值。見圖2。

表2 不同喂養(yǎng)方式的早產(chǎn)兒和足月兒尿液HCMV DNA表達情況[n（%）]

圖1 產(chǎn)后8周哺乳母親乳汁中HCMV DAN載量變化

圖2 病毒傳播者母親與非傳播者母親乳汁DNA載量比較

3 討論

實時熒光定量PCR檢測體液中病毒DNA載量是診斷HCMV感染可靠敏感的指標[10]，與既往的報道一致[1,5]，嬰兒尿液HCMV-DNA陽性率顯著高于PBMC，表明多數(shù)嬰兒感染是局部的而非全身性的，所以尿液作為病毒載量檢測標本敏感性更高。無論母乳喂養(yǎng)還是奶粉喂養(yǎng)，早產(chǎn)兒都比足月兒的感染率更高，說明前者對HCMV更為易感，與其它研究結(jié)果一致[2-3]。可能因為早產(chǎn)兒較足月兒免疫系統(tǒng)等各方面發(fā)育略為遲緩，因此更易發(fā)生感染性疾病[11]。研究表明HCMV病毒復制可以發(fā)生在腺上皮細胞，并將病毒排入乳汁。產(chǎn)后6周內(nèi)，乳汁HCMV DNA陽性率持續(xù)升高，表明越來越多的母親發(fā)生了復發(fā)感染，同時，嬰兒的感染率液隨之增高。處于哺乳期的母親，其乳腺細胞中活性物質(zhì)的產(chǎn)生和積累促使HCMV病毒復制[12-14]，而含有病毒的乳汁喂養(yǎng)嬰兒導致的感染率更高，表明母乳喂養(yǎng)是HCMV母嬰傳播的重要途徑，這與其他研究結(jié)果一致[3,5-6]，隨著乳汁病毒含量的增高，嬰兒感染率也升高。根據(jù)病毒傳播者和非傳播者之間乳汁病毒DNA載量的差異，建議2600 copies/mL作為傳播者的臨界值。由此一來，可以監(jiān)測個體乳汁病毒載量以評估其傳播風險。但母乳是嬰兒最為理想的天然食物，除了提供營養(yǎng)，乳汁還為嬰兒帶來免疫、發(fā)育和心理等方面的好處。因此需要研究出殺滅乳汁中病毒成分同時又不損傷乳汁營養(yǎng)成分的方法并引入臨床實踐當中[15]。在后續(xù)研究中，將對比巴氏滅菌、冷凍復融等方法對母乳中HCMV的清除作用及其對嬰兒感染率的影響，為臨床提供可行的預防嬰兒HCMV感染的方法。

綜上所述，母乳喂養(yǎng)是HCMV重要的母嬰傳播途徑；檢測尿液病毒DNA對于兒童HCMV感染具有診斷意義；早產(chǎn)兒較足月兒對HCMV具有更高的易感性。

[1]Kohda C，Chiba N，Shimokoba K，et al.A simple smart amplification assay for the rapid detection of human cytomegalovirus in the urine of neonates[J].J Virol Methods，2014，208：160-165.

[2]miechura M，Struzycka M，Konopka W.Congenital and acquired cytomegalovirus infection and hearing evaluation in children[J].Otolaryngol Pol，2014，68（6）：303-307.

[3]Alkhawaja S，Ismaeel A，Botta G，et al.The prevalence of congenital and perinatal cytomegalovirus infections among newborns of seropositive mothers[J].J Infect Dev Ctries，2012，6（5）：410-415.

[4]Jackson SE，Mason GM，Wills MR.Human cytomegalovirus immunity and immumeevasion[J].Virus Res，2011，157（2）：151-160.

[5]徐莉莉，牟文鳳，楊麗，等.嬰兒血液、尿液及母乳中病毒DNA檢測在診斷人巨細胞病毒感染中的應用[J].中國當代兒科雜志，2013，15（9）：748-750.

[6]Neirukh T，Qaisi A，Saleh N，et al.Seroprevalence of Cytomegalovirus among pregnant women and hospitalized children in Palestine[J].BMC Infect Dis，2013，13：528.

[7]陸佳飛，周科隆，王縵.磁珠快速提取乙型肝炎病毒DNA方法的建立及其應用研究[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2012，35（9）：843-850.

[8]Gohring K，Dietz K，Hartleif S，et al.Influence of different extraction methods and PCR techniques on the sensitivity of HCMV-DNA detection in dried blood spot（DBS）filter cards[J].J ClinVirol，2010，48（4）：278-281.

[9]Grosjean J，Trapes L，Hantz S，et al.Human cytomegalovirus quantification in toddlers saliva from day care centers and emergency unit：a feasibility study[J].J ClinVirol，2014，61（3）：371-377.

[10]Harkins LE，Matlaf LA，Soroceanu L.Detection of human cytomegalovirus in normal and neoplastic breast epithelium[J].Herpesviridae，2010，1（1）：8.

[11]deVries JJ，Claas EC，Kroes AC，et al.Evaluation of DNA extraction methods for dried blood spots in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection[J].J ClinVirol，2009，46S（4）：S37-S42.

[12]黃蓮芬.乙肝病毒感染或攜帶產(chǎn)婦檢測乳汁乙肝病毒DNA結(jié)果分析[J].中國醫(yī)藥導報，2011，8（22）：90-91，93.

[13]趙巍松，劉伶，楊飛，等.母乳及嬰兒血液、尿液人巨細胞病毒DNA檢測在嬰兒HCMV感染中的應用[J].中國實驗診斷學，2013，17（6）：1059-1061.

[14]何佳英，張迎華，張永樂，等.乙型肝炎病毒感染產(chǎn)婦乳汁中乙型肝炎病毒DNA載量對母乳喂養(yǎng)的指導意義[J].中華預防醫(yī)學雜志，2011，45（11）：1004-1006.

[15]Yinon Y，F(xiàn)arine D，Yudin MH.Screening，diagnosis，and management of cytomegalovirus infection in pregnancy[J]. Obstet Gynecol Surv，2010，65（11）：736-743.

Loads change of HCMV in breast milk and the risk of transmission via breast milk

WANG TingCUI HuilingDUAN GehongCHEN MaocaiJI Hengtao
Department of Medical Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University,He'nan Province,Zhengzhou 450014,China

Objective To discuss the loads change of HCMV in breast milk and to reveal the risk of transmission to infants via breast-feeding.Methods From September 2013 to October 2014,305 lactating mothers admitted to Obstetric Department of the Second Affiliated Hospital,and their 308 infants were screened for HCMV,with 103 formula-fed infants in the same period were selected as control.HCMV DNA isolated from breast milk,urine and peripheral blood mononuclear cells(PBMC)was detected by real-time PCR.Results The accumulative DNAlactia(+)was 44.92%during the first 6 weeks postpartum,including 73 transmitters and 72 non-transmitters.But transmitters had significantly higher DNA load than non-transmitters[(4.70±1.26)vs(3.08±0.88)],the difference was statistically significant(P＜0.01). Breast-fed infants with DNAlactia+milk were found more DNAuria(+)(50.68%)than breast-fed infants with DNAlactia-milk(3.70%)and formula-fed babies(9.71%),the difference was statistically significant(P＜0.01).And preterm babies breast-fed and formula fed had significant higher DNAuria(+)(83.33%,37.50%)than term ones(47.76%, 7.37%),the differences were statistically significant(P＜0.05).84%puerpera with milk viral DNA loads＜3.42 spread the virus to infants,and 75%puerpera with milk viral DNA loads＜3.42 had not spread the virus to infants,so 2600 copies/mL(lg2600=3.42)was the cut-off viral DNA load.Conclusion Breast milk is a main source for transmission and a proposal cut-off viral DNA load is defined as 2600 copies/mL in milk for potential maternal virus transmitters. Preterm infants seem more vulnerable to HCMV infection and the analysis of urine from children for the presence of DNA is more valuable for the diagnosis of HCMV.

Human cytomegalovirus;Transmission;Breast milk;Viral DNA

R511

A

1673-7210（2015）07（c）-0063-04

2015-04-23本文編輯：任念）

河南省醫(yī)學科技攻關(guān)計劃項目（201403085）。

王婷（1976-），女，碩士，主要從事病原體分子診斷學研究。

崔會玲（1957-），女，副主任技師，主要從事病原體免疫學研究。