傳染性法氏囊病病毒VP5蛋白的研究進展

尹 偉 孫啟才

（1.浙江大學醫學院公共技術平臺，浙江 杭州310058；2.浙江醫院七病區骨科，浙江 杭州310007）

傳染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）引起的一種免疫缺陷性和免疫抑制性疾病，病毒主要通過侵害3～6周齡雛雞的法氏囊中樞免疫器官，給養禽業造成重大損失。IBD最早在1957年首次在美國特拉華州南部的甘波羅鎮（Gumboro）發現（故又稱甘波羅病）[1]，1962年由Winterfield分離鑒定。迄今為止，IBDV血清型分為血清I型和血清Ⅱ型，但只血清I型病毒有致病性。根據致病特征和抗原性的差異，血清I型中又分為經典毒株、變異株和超強毒株（vvIBDV）[2]。經典毒株以法氏囊水腫為特征，世界各地廣泛流行；1985年首次在美國特拉華州地區肉雞中分離到變異株，導致法氏囊迅速萎縮和嚴重的免疫抑制，以及感染雞肝壞死和脾臟腫大，但未見有水腫。1987年，荷蘭、比利時等國家報道了超強毒株，后在亞洲、非洲和南美洲均有報道。超強毒株在抗原上與經典毒株相同，但病死率高達30%～70%，法氏囊嚴重出血，外觀呈“紫葡萄”樣。

1 IBDV基因組結構

IBDV基因組由A和B兩個節段組成。其中A節段含有兩個ORF，編碼 VP2、VP3、VP4 及 VP5 蛋白；B 節段只含有一個 ORF，編碼的VPl蛋白(90ku)是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)。與病毒dsRNA復制有關，同時還具有鳥苷酸轉移酶和甲基轉移酶活性[3]。VP2、VP3是病毒的主要結構蛋白，構成病毒衣殼的主要成分。VP2具有一個構象依賴性（不連續）的中和抗原決定簇，其誘導的中和抗體能被動地保護宿主不受IBDV感染（變異株和超強毒株除外），故一般認為VP2是病毒的宿主保護性抗原，與病毒中和抗體的誘導、抗原和毒力的變異、細胞凋亡相關；VP3具有一個非構象依賴性（連續）的抗原決定簇，是病毒群特異性抗原。VP4是一種具有蛋白酶活性的病毒多肽，在病毒蛋白的成熟過程中起著重要作用。基因組A節段中大ORF上游并與之部分重疊的另外小ORFA編碼非結構蛋白（NP），即VP5蛋白。

2 VP5蛋白的發現

1990年，Hhvarstein通過對IPNV和IBDV核酸和氨基酸序列比對，發現pVP2的N端和C端高度保守，而中間區相對活躍；而且在IPNV和IBDV的A節段發現除了有一個大的ORF（2916bp），還有一個與之重疊的選擇性小ORF（444bp），編碼一個17KDa的多肽，通過對純化的放射性（甲硫氨酸）標記IPNV粒子的SDS-PAGE鑒定確定了該蛋白的存在，命名為VP5蛋白[4]。

直到1995年，Mundt等人通過原核表達ORFA-2，獲得一個大小為21kDa蛋白，免疫兔子制備多抗，用該多抗在感染IBDV的CEC（雞胚胎細胞，chicken embryo cells）和感染IBDV雞的法氏囊樣本（western-blot、放射性免疫沉淀、IFA）檢測到該蛋白，證明了ORFA-2蛋白的存在（但其大小不是預測的17kDa，而是21kDa左右），由此命名為IBDV VP5[5]。

3 VP5的分子學特征

VP5基因由435～447個核苷酸組成，編碼一個含145～149個氨基酸，17kDa左右大小的蛋白。迄今已經報道的VP5基因序列都很保守。氨基酸序列分析表明，IBDV血清Ⅰ型VP5之間（98.6～11%）比Ⅱ型之間（92～94%）保守，而血清Ⅰ型和Ⅱ型之間氨基酸差異較大（28個氨基酸的差異）。但所有的亞型VP5都富含半胱氨酸，這些半胱氨酸大部都很保守，只在105～108之間有所區別。Schroder等通過對嵌合病毒的研究發現，VP5與血清分型無關。基于序列拓撲學的預測表明，VP5是一個Ⅱ型跨膜蛋白，具有細胞質N末端區和細胞外C末端區，在69～88位氨基酸之間存在一個潛在的跨膜螺旋區[6]。

圖1

4 VP5的功能學研究

Tan等通過對各個密碼子的堿基使用慣性的聚類分析，發現VP5基因堿基聚集習慣不同于其他四種基因，表明該基因來源于病毒的疊印戰略，即有通過利用已經存在的基因未使用的閱讀框產生新的基因[7]。

Wang等發現VP5在強毒株的減毒過程中發生了特定的氨基酸突變，因此認為其與IBDV強毒表型相關[28]，揭示了Uruguayanhypervirulent IBDV株（vvIBDV）缺少目前為止描述的vvIBDV具有的可選性的AUG起始密碼子的特征。而是和經典毒株和變異毒株一樣，該VP5基因具有一個位于四個密碼子下游的AUG起始密碼子，因此其編碼一條長145個氨基酸的蛋白而不是其他vvIBDV推定的長149個氨基酸的蛋白。盡管如此，這些病毒保留了強致病性毒株的VP5和VP2氨基酸特征，并集聚了vvIBDV相關序列。這一發現可以為VP5可以通過改變翻譯起始位點而進化提供證據。

4.1 VP5蛋白與病毒復制的關系

Mundt等人雖然在感染的細胞和組織中檢測到VP5，但是未能在病毒顆粒中檢測到[9]，證明了其為非結構蛋白，建立了IBDV反向遺傳學系統,利用該系統，通過點突變VP5起始密碼子（ATG→AGG），獲得缺失VP5的IBDV突變體，該突變體能夠在細胞中復制，但是缺失VP5的IBDV相對于未缺失VP5的IBDV其復制延遲，但最終獲得的病毒滴度差異不大，揭示了VP5并不是IBDV在細胞中復制所必需。1998年，YAO等也利用該反轉錄系統，通過突變起始密碼子ATG為終止密碼子TAG，沉默VP5，獲得VP5缺失突變體，在體外和體內同時證明了VP5不是IBDV復制所必需[10]。

4.2 VP5蛋白與致病性的關系

YAO等發現拯救的VP5缺失感染性克隆，轉染CEF后引起的細胞病變明顯低于對應的弱毒活疫苗D78，細胞毒性和引起的凋亡程度大大下降；體內實驗表明，拯救的VP5缺失感染性克隆，不能引起雞的病理損傷和該病的臨床癥狀[10]。由此可見VP5在致病性方面起著重要作用。

Qin等在vvIBDV Gx的基礎上構建了一株VP5缺失病毒，將缺失VP5 的 IBDV（rGx-F9VP2△VP5）和未缺失 VP5的 IBDV（rGx-F9VP2）體外實驗發現該缺失株表現為較低病毒滴度和細胞毒性；體內實驗，接毒SPF雞，在免疫AIV，發現缺失VP5的IBDV其引起的較弱免疫抑制，由此也證明了無論在體內還是在體外，VP5在病毒的復制和致病性方面都發揮著重要作用[11],同時指出構建VP5缺失疫苗株存在可行性。

4.3 VP5蛋白與細胞毒性和細胞凋亡的關系

Lombardo等[12]通過用IBDV感染CEF、重組痘苗病毒載體感染BSC-1細胞、真核表達載體瞬時轉染COS-1細胞這三種途徑表達VP5蛋白，免疫熒光分析發現VP5表達后積聚在細胞膜上，并能使細胞膜的通透性升高以致能通過植物血凝素和IgG這樣的大分子。VP5的表達呈現出強烈的細胞毒性，包括細胞形態學的改變，細胞膜的破裂和細胞活力的急劇下降，這種細胞毒性和VP5在包膜內側的積聚均可以被Brefeldin A(BFA)所阻斷，因此推測VP5蛋白在子代病毒的釋放過程中發揮作用。

Li等通過實驗證明，IBDV病毒蛋白5（VP5）是主要的凋亡誘導劑[13]，通過小干擾RNA沉默抑制IBDV VDAC2明顯誘導細胞凋亡與下降的caspase-9和3的激活和細胞色素c釋放，導致宿主細胞株生長增加。因此，VP5誘導的細胞凋亡在IBDV感染是通過與VDAC2介導的，出現的蛋白質限制病毒復制，誘導細胞死亡。

總之，VP5蛋白在子代病毒的釋放過程中，起什么作用，以及如何起作用的，現在還未清楚；由于發表文獻的結果矛盾，VP5是否具有細胞凋亡作用，仍未確定。

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