OBHS對C6神經膠質瘤細胞H2O2損傷的保護作用

鄧麗娟，駱淑媛

（武漢東湖學院 生命科學與化學學院，湖北 武漢430212）

1 引言

阿爾茨海默病（AD）是一種慢性進行性的中樞神經系統退行性疾病，有研究表明氧化應激參與了AD的發生，但其具體的發病機制仍不十分清楚。目前，雌激素替代療法廣泛用于AD的預防與臨床治療，但是長期使用雌激素會增加患者罹患中風、心血管疾病以及乳腺癌和宮頸癌的危險，因此限制了雌激素的臨床應用［1，2］。選擇性雌激素受體調節劑（SERMs）是一類具有類雌激素激動或拮抗作用的人工合成化合物，可以直接代替雌激素發揮作用，而副作用遠小于雌激素。因此本研究以H2O2損傷的神經膠質瘤母瘤細胞C6為模型，探討了OBHS對神經膠質瘤細胞H2O2損傷的保護作用，為AD藥物防治研究提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 主要試劑與儀器

DMEM培養基和胎牛血清均購于Hyclone公司，FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I購于BD Biosciences公司，Bcl-2抗體購于Santa Cruz公司。

2.2 方法

2.2.1 H2O2損傷模型建立

收集處于對數生長期的C6細胞，調整細胞密度為105個細胞/mL，接種于96孔培養板，37℃，5%CO2環境下培養24h后，設置對照組和濃度處理組，H2O2終濃度分別為0、100、150、200、250、300μmol/L，每組4個重復孔。培養24h后，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μl，37℃繼續孵育4h后，吸去孔內培養上清液，每孔加入100μLDMSO，振蕩10min。在酶標儀上以OD570為測定波長，OD630為參考波長，測定吸光值。空白對照組MTT代謝率設為100%，重復3次，建立氧化損傷模型。

2.2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡

各處理組收集細胞，PBS洗滌2次，bingding buffer重新懸浮細胞至1×106個細胞/L，取100μL上述溶液，加5μL FITC Annexin Ⅴ和5μL PI，室溫避光靜置15min后，加400μL bingding buffer，過濾后1h內進行流式細胞分析，測定壞死、凋亡和正常細胞的百分率。

2.2.3 Western－blot檢測

收集細胞，PBS洗滌2次，加上樣緩沖液重懸細胞，100℃煮沸10min，13 000r/min，離心10min，取上清。以10%分離膠進行SDS-PAGE，半干電轉至NC膜，室溫封閉1h，加一抗4℃過夜，二抗室溫反應1h，顯影。

2.3 統計學方法

應用Origin 8.0軟件分析處理數據，使用Turkey檢驗及One-way ANOVA方差檢驗來判斷實驗結果是否具有差異。p＜0.05時認為是差異顯著，具有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 H2O2損傷模型的建立

采用不同濃度的H2O2處理C6細胞后，MTT檢測細胞活性，實驗結果表明：隨著H2O2濃度的增加，細胞活力逐漸下降，具有濃度依耐性，當 H2O2濃度達到250μmol/L時，細胞活力只有60.9%±2.93%（p＜0.01），達到預期損傷值（圖1）。

不同濃度的H2O2作用C6細胞24h后，MTT檢測細胞存活率。所示數據為mean±SD，n=4；＊＊P＜0.01，vs空白對照組。

3.2 OBHS抵抗H2O2毒性作用

采用流式細胞術檢測1μmol/LOBHS預處理24h對H2O2損傷C6細胞的影響，實驗結果表明：在H2O2處理組中，細胞存活率為60.04%，而在OBHS預處理組中，細胞存活率上升至82.34%（圖2-B），說明OBHS具有對抗由H2O2所誘導的C6細胞損傷的能力。

（A）OBHS結構式；（B）OBHS（1μmol/L）預處理C6細胞24h后，加入 H2O2（250μmol/L）作用24h，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。R2區為壞死細胞，R3區為晚期凋亡細胞，R4區為正常細胞，R5區為早期凋亡細胞。

3.3 OBHS影響抑凋亡蛋白Bcl－2的表達

在C6細胞中，H2O2作用24h后，細胞內Bcl-2蛋白質的表達量會有顯著下降，而用OBHS預處理24h后可以回復H2O2引起的Bcl-2下調作用（圖3）。

OBHS（1μmol/L）預處理 C6細胞24h后，H2O2（250μmol/L）作用24h，western-blot檢測Bcl-2蛋白質表達水平。所示數據為 mean±SD，n=3；＊P＜0.05，vs空白對照組；＃P＜0.05，vs H2O2實驗組。

4 討論

有許多研究表明，氧化壓力是很多人類疾病包括神經退行性疾病的細胞損傷的主要原因。活性氧類物質（雙氧水、超氧化物陰離子等）易于損傷細胞內的生物大分子，最終導致細胞凋亡或壞死。因此，通過抗氧化物來消除過多的活性氧類物質或是抑制它們的產生，可能是阻止氧化壓力造成細胞損傷的有效方法。

OBHS是人工合成的一種選擇性雌激素受體調節劑［3］，有較強的抗炎 癥功能［4，5］，具有 廣 泛的 應用 前 景。而有研究表明具有酚羥基結構的物質通常有一定的抗氧化的功能［6］，OBHS作為一種人工合成的SERMs，含有兩個酚羥基結構（圖2-A），因此我們推測OBHS可能也具有抗氧化的能力。而實驗結果顯示，OBHS能抑制H2O2引起的細胞損傷，并回復細胞內抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達。因此，我們推測可能是OBHS具有抗氧化能力，消除了H2O2產生的氧化壓力，從而恢復了細胞內Bcl-2基因的正常表達，抑制了細胞凋亡，達到神經保護的效果。

綜上所述，本研究通過加入H2O2建立氧化損傷模型，檢測到新型選擇性雌激素受體調節劑OBHS具有強的抗氧化能力，能減緩H2O2所誘導的細胞損傷，具有神經保護作用。

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