白銀市番茄黃化曲葉病毒的鑒定

李春雷， 文朝慧， 王溪橋， 尤 佳

（甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，甘肅 蘭州 730010）

番茄（Solanum lycopersicum Mill.）屬茄科番茄屬，是世界上最重要的蔬菜作物之一［1］。番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）是一種雙生病毒（geminiviruses）病害，以煙粉虱作為傳播媒介［2］。其大面積爆發對經濟發展造成了不同程度的破壞［3～6］。據不完全統計，目前我國番茄黃花曲葉病毒病年發生面積超過6.7萬hm2，年經濟損失至少20億元［7］。2011年，甘肅省武山縣首次發現TYLCV，2012年，相繼在武威市涼州區、民勤縣的日光溫室發現TYLCV，并于2013年在武威市設施番茄主產區開始流行蔓延，造成嚴重損失［8～10］。鑒于此，我們對發生于白銀市的疑似TYLCV樣品進行分子鑒定，并進行了序列同源性比對及系統發育關系的分析，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

在甘肅白銀市水川鎮張莊村選取上部葉片黃化、邊緣向上卷曲、植株生長變緩甚至停滯，矮化變小，具有典型黃化曲葉病毒病癥狀的番茄葉片。DNA提取試劑盒（PlantGenomic DNA Extraction Kit）購自天根生化科技有限公司；PCR反應體系試劑購自寶生物工程有限公司。引物的合成與片段測序由大連寶生物工程有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 特異性引物的設計 根據李常保等的研究［11］，合成了上游引物TYLCV-F：5'-ACGCATGCCTC TAATCC AGTGTA- 3'和 TYLCV-R：5'-CCAATAAGGCGTAAGCGTGTA GAC-3'。所要擴增的目的條帶為543 bp。該引物是針對TYLCV的特異區段設計，只與TYLCV的特異區結合，因此，可以通過PCR技術來判斷白銀地區番茄植株是否感染TYLCV。

1.2.2 植物基因組DNA提取及PCR擴增 取具有番茄黃化曲葉病毒病癥狀的番茄葉片，按照植物基因組DNA提取試劑盒的說明提取番茄基因組DNA，利用引物TYLCV-F和TYLCV-R進行PCR擴增。擴增體系為25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL，dNTP（10mmol/L）1μL，DNA模板3μL，上下游引物（10mmol/L）各1μL，rTaq酶（5 U/μL）0.5μL，ddH2O 16μL。PCR擴增條件為：第一階段，94℃預變性4min；第二階段，94℃變性45 s，50℃復性45 s，72℃延伸1min，共35個循環；第三階段，72℃延伸10min。PCR產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，最后利用凝膠自動成像儀檢測拍照。

2 結果與分析

2.1 番茄黃化曲葉病毒病的田間感病表現

如圖1所示，采集的番茄植株樣品表現為矮縮、生長變緩甚至停滯，葉片邊緣逐漸黃化且變小，符合黃化曲葉病毒病的發病癥狀。

2.2 番茄黃化曲葉病毒病的PCR 鑒定

以感病番茄葉片的病毒DNA為模板進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。得到543 bp大小的特異性條帶，以水為模板的PCR結果無條帶。將測序結果（圖3）在NCBI網站（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）上進行BLAST比對，結果表明PCR擴增所得的543 bp序列的特異性條帶是番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）的部分序列，根據以上結果，可以診斷確定白銀地區的番茄感染了TYLCV。

圖1 番茄田間感病表型

M 1 2 3

圖2 凝膠電泳檢測結果

圖3 PCR產物回收測序結果

3 小結與討論

1） 以李常保等研究為依據［11］，以PCR技術為鑒定方法，對白銀地區的番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）進行了分子鑒定。結果表明，從具有典型番茄黃化曲葉病毒病病癥的植株上所采集的病毒，經過PCR檢測及測序比對分析后，證實其確實為TYLCV，同時證明通過PCR技術可以方便快捷、準確高效地檢測到番茄所感染TYLCV的情況。

2） 番茄黃化曲葉病毒病的危害嚴重，且依靠煙粉虱來傳播，傳播廣泛，已經成為威脅番茄產量與品質的重要病害。在生長發育早期染病的番茄，其生長、開花和座果將受到嚴重影響，甚至導致毀滅性的絕產；在生長發育后期染病的番茄，番茄的上部葉片及新生葉結果少且小，嚴重影響了番茄的產量及品質［12］。

3） 番茄黃化曲葉病毒病一旦大面積的發生，會給經濟造成不可估量的損失，因此，今后的研究還應著重培育適合不同地區種植的抗番茄黃化曲葉病毒病的番茄品種，并著重追蹤該病毒的變異以及進化情況，從而有效的控制病情并為培育新的抗病品種奠定理論依據。

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［12］ 劉劍峰，肖啟明，張德詠，等. 番茄黃化曲葉?。═YLCV）的研究進展［J］. 中國農學通報，2013，29（13）：70-76.