8-異丙胺亞甲基橙皮素(IPHP)在Caco-2細胞模型上跨膜轉運的研究

胡婷婷，黃　成，孟曉明，陳昭琳，沈陳林，李　俊

(安徽醫科大學藥學院，安徽天然藥物活性研究省級實驗室，安徽省創新藥物產業共性研究院，安徽合肥　230032)

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8-異丙胺亞甲基橙皮素(IPHP)在Caco-2細胞模型上跨膜轉運的研究

胡婷婷，黃成，孟曉明，陳昭琳，沈陳林，李俊

(安徽醫科大學藥學院，安徽天然藥物活性研究省級實驗室，安徽省創新藥物產業共性研究院，安徽合肥230032)

摘要:目的利用Caco-2細胞模型研究8-異丙胺亞甲基橙皮素(IPHP)在小腸吸收轉運的機制。方法在Caco-2細胞模型上進行IPHP的跨膜轉運實驗，探討藥物濃度、pH、溫度、P-gp抑制劑維拉帕米、MRP2抑制劑MK-571和丙磺舒對IPHP在體外細胞模型上跨膜轉運的影響。結果IPHP在Caco-2細胞模型上的轉運具有一定的濃度依賴性，IPHP不同濃度從A側到B側的滲透系數P(app)(AP-BL) (×10(－5))分別為: (2.21±0.200)、(3.56±0.306)、(3.81±0.179)、(4.23±0.229)、(4.17±0.262) cm·s(－1)，B側到A側的滲透系數P(app)(BL-AP) (×10(－5))分別為: (3.57±0.209)、(4.51±0.113)、(4.97±0.229)、(5.24±0.550)、(5.07± 0.557) cm·s(－1)，外排率分別為:1.61、1.26、1.3、1.23、1.21。溫度和pH對其轉運均有影響，而P-gp抑制劑對于IPHP的轉運沒有明顯的影響，MRP2抑制劑在一定程度上增加了IPHP的轉運量(P＜0.05)。結論IPHP在Caco-2細胞模型上的轉運方式主要是被動擴散，且其轉運不受P-gp外排蛋白影響，而外排蛋白MRP2可能參與了IPHP的外排轉運。

關鍵詞:IPHP; Caco-2細胞;吸收;外排;滲透系數;被動擴散;高效液相色譜

橙皮素(hesperetin)為蕓香科植物柑橘屬植物果實提取物，是廣泛存在于柚子和橙子中二氫黃酮類化合物，具有廣泛的藥理學特性，包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤形成與生長等活性［1－3］。橙皮素口服以后生物利用度較好，但是半衰期較短，口服給藥以后體內消除較快，為了維持有效血藥濃度，需要頻繁給藥，這一缺點限制了其在臨床上的應用［4］。為了克服這一缺點，本課題組通過化學合成的方法，合成了一系列的橙皮素衍生物并對其藥理活性進行了篩選。本課題組前期研究發現，7，3'-二甲氧基橙皮素(7，3' -dimethoxy hesperetin，DMHP)具有較強抗炎活性，對AA大鼠繼發性炎癥具有良好的治療作用［5－7］。前期研究還發現8-異丙胺亞甲基橙皮素(IPHP，見Fig1)，在體外具有良好的抗炎活性，對于由LPS刺激RAW264.7細胞產生的TNF-α和IL-6具有明顯的抑制作用。該實驗利用Caco-2細胞模型來模擬小腸上皮細胞對IPHP的吸收情況，通過對Caco-2細胞膜上轉運蛋白，如P糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥蛋白(MRP2)的研究來探討其吸收及外排機制，為之后的藥理學研究提供依據，為新型藥物單體的合成提供信息指導，為將來的臨床前研究提供資料。

3'，5，7-trihydroxy-8-isopropylaminomethyl-4'-methoxyflavanone (IPHP)Fig 1 Structure of IPHP

1　材料與方法

1.1細胞、藥品與試劑Caco-2細胞株購于武漢博士德公司，傳代數為30代; IMDM(博士德公司，批號: 04D24C59)，胰蛋白酶(博士德公司，批號: 03C28C15) ; DMSO，美國Gibco公司; Hanks液(碧云天) ; IPHP(本實驗室合成，純度＞95%) ;橙皮素對照品(西安小草植物科技有限責任公司，純度＞98%，批號: XC1009018) ;橙皮苷標準品(中國藥品生物制品檢定所，純度＞98%，批號: 110721-200613) ; MK-571和丙磺舒(美國Sigma公司) ;維拉帕米(NICPBP，批號: 100223200102) ;甲醇為色譜純;水為雙蒸水，其余所有試劑為分析純。

1.2儀器LC-20A四元低壓梯度液相色譜儀(日本島津公司) ; XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司) ; Neofuge23R臺式高速冷凍離心機(力康發展有限公司) ; DZE-6050型真空干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司) ; SHA-C水浴恒溫振蕩箱器(江蘇金壇億通電子有限公司) ;酶標儀，荷蘭雷勃公司產品;懸掛式培養皿(Millicell-CPI) ; DDs-12A數字電導儀(Millicell-ERS) (美國Millipore公司) ; SW-CJ-IF型超凈臺，江蘇蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司產品; NAPCO-6100型細胞培養箱，美國SHELLAB公司產品;高速離心機(珠海黑馬公司)。

1.3Caco-2細胞培養及其單層的制備Caco-2細胞接種在12孔Millicell-CPI培養板上(底面積: 1.13 cm2，微孔: 3 μm)，種植密度為1×105cells· cm－2，在A側和B側分別加0.6 mL及1.2 mL的培養基放入37℃孵箱中孵育。每隔1天換1次液，培養約3周達到匯合、分化形成單細胞層。Caco-2細胞生長、匯合、分化在Millicell CPI膜上，細胞單層的緊密性與完整性是藥物轉運實驗的基礎。用顯微鏡下觀察細胞的生長形態，同時每次換液時需要用DDs-12A數字電導儀測量跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)，當TEER＞350 Ω ·cm2時細胞可用于實驗。

1.4MTT實驗Caco-2細胞按照一定的密度接種于96孔板中，放入37℃孵箱中培養24 h后，棄去培養基，分別加入IPHP濃度為7.5、15、30、60、120、240、480 μmol·L－1的200 μL的培養液，37℃孵育24 h后，每孔再加入20 μL MTT溶液(5 g·L－1，即0.5% MTT)，繼續培養4 h，終止培養，小心吸去孔內培養液。每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(A)，計算細胞存活率(IC) : IC/%=(試驗組A均值－調零空A均值)/(對照組A均值－調零空A均值)×100%。選取細胞存活率在80%以上的藥物濃度作為實驗所需的安全濃度。

1.5轉運實驗Caco-2細胞在Millicell-CPI培養板上形成緊密完整的單細胞層后，各孔貼側壁加入37℃的Hanks液，蕩洗細胞3次。吸干各孔內Hanks液，在不破壞單細胞的基礎上祛除細胞表面的雜質，之后用Hanks液于37℃孵育30 min。將IPHP溶于DMSO制備成240 mmol·L－1的溶液，用Hanks液稀釋至7.5、15、30、60、120 μmol·L－1的IPHP溶液。其中DMSO的濃度小于0.1%將不會影響單細胞層的完整性。孵育結束以后，在單層細胞膜內的一側加入含藥Hanks溶液，另一側加入空白Hanks液，空白對照孔在兩側均加Hanks液。當研究藥物分子從A側向B側方向轉運時，A側加0.6 mL含IPHP的Hanks轉運液，B側加入1.2 mL Hanks液，當研究藥物分子從B側向A側方向轉運時，A側加0.6 mL Hanks液，B側加1.2 mL含IPHP的Hanks液，分別于0、30、60、90和120 min時從A側及B側取轉運液置于1.5 mL離心管中，放入－20℃冰箱中保存待測。為了探究pH對于IPHP轉運吸收的影響，將含IPHP(120 μmol·L－1)的Hanks液分別在pH 5.5或pH 9.0條件下進行吸收轉運實驗。實驗過程同上所述。探究溫度是否對IPHP的吸收有影響，將含IPHP (120 μmol·L－1)的Hanks分別在4℃和37℃情況下按上述實驗方法進行。

IPHP在Caco-2細胞的吸收轉運是否涉及到某些轉運蛋白的介導，需要我們進一步研究。將P-gp抑制劑維拉帕米(50 μmol·L－1)，MRP2抑制劑MK-571(50 μmol·L－1)和丙磺舒(1 mmol·L－1)分別溶于Hanks液中。轉運實驗之前，將Caco-2細胞單層模型用含有抑制劑的Hanks液于37℃孵育30 min，之后按照上述實驗方法進行轉運實驗。

1.6樣品分析本實驗采用高效液相色譜法分析樣品，色譜柱: Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm) ;流動相:乙腈－0.5%甲酸梯度洗脫(0～5 min，76∶24; 5～15 min，76∶24～30∶70; 15～16 min，30∶70～76∶24; 16～24 min，76∶24) ;檢測波長: 288 nm;流速: 1.0 mL/min;柱溫: 40℃;進樣量:20 μL。

Tab 1 The IC(%) value at different IPHP concentration(±s，n=5)

Tab 1 The IC(%) value at different IPHP concentration(±s，n=5)

Concentration/μmol·L－17.5　15　30　60　120　240　480 IC/%　98.74±1.21　93.32±1.22　87.52±7.21　86.51±12.23　80.30±4.58　79.26±15.53　65.26±7.14

1.7數據分析藥物分子透過單細胞層的表觀滲透系數:表觀滲透系數計算公式為: Papp=(dQ/dt)/A×C0，其中dQ/dt是單位時間內藥物的轉運量(nmol·s－1)，A是聚碳酯膜的表面積，C0為供給室中待測物的初始濃度。外排率計算公式為: ER=Papp(BL－AP)/Papp(AP－BL)。所有數據以±s表示，數據采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗。

2　結果

2.1Caco-2細胞單層膜完整性在顯微鏡下觀察Caco-2細胞形態學的完整性，可觀察到Caco-2細胞形成致密的緊密連接，細胞融合成連續的單層。用DDS-12A數字電導儀測量跨膜電阻(transepithelial electrical resistance，TEER)，檢測到TEER均大于350 Ω·cm2。實驗結果說明Caco-2細胞已經形成了完整的單細胞層，可以用于藥物跨膜轉運實驗。

2.2MTT實驗結果Caco-2細胞在IPHP濃度為7.5、15、30、60、120、240、480 μmol·L－1在24 h的存活率分別為: 98.74%、93.32%、87.52%、86.51%、80.30%、79.26%、65.26%。由Tab 1結果可知，當IPHP的藥物濃度小于120 μmol·L－1時，細胞的存活率大于80%。因此，本實驗所采用的藥物濃度低于120 μmol·L－1，此時藥物對細胞的作用在安全濃度范圍內。

2.3IPHP在Caco-2上的跨膜轉運實驗

2.3.1藥物濃度對IPHP轉運的影響采用高效液相色譜法檢測標準品、空白Hanks液、空白Hanks加橙皮素，IPHP和內標橙皮苷、IPHP在Caco-2細胞轉運樣品的色譜圖見Fig 2，空白Hanks不干擾測定。高效液相色譜法測定不同時間點不同濃度下單細胞層兩側培養液中IPHP的濃度，結果見Fig 3。隨著藥物濃度的增加，Caco-2細胞對IPHP的攝取量逐漸增加，并且外排率ER分別為: 1.61、1.26、1.30、1.23、1.21。結果見Tab 2。

Fig 2　HPLC chromatograms of standard hesperidin，IPHP and hesperitin (A)，blank Hanks (B)，blank Hanks sample spiked with hesperedin，IPHP and hesperetin (C)，Hanks sample obtained 30 min after transport of IPHP from A to B?side (D).

Fig 3 Cumulative amount-time curve of IPHP inCaco-2 cell model(A→B and B→A，±s，n=3)

Tab 2 Effect of concentration on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

Tab 2 Effect of concentration on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

Bi-directional apparent permeability coefficients (Papp) of IPHP across Caco-2 cell monolayers.

InitialPapp(APBL)Papp(BLAP)Papp(BLAP)/Compoundconcentrations→　→　→/μmol·L－1/×10－5cm·s－1/×10－5cm·s－1Papp(AP→BL) 7.5　2.21±0.200　3.57±0.209　1.61 15　3.56±0.306　4.51±0.113　1.26 IPHP　30　3.81±0.179　4.97±0.229　1.30 60　4.23±0.229　5.24±0.550　1.23 120　4.17±0.262　5.07±0.557　1.21

2.3.2pH對IPHP轉運的影響pH對藥物的吸收的結果如Fig 4所示，pH 5、pH 7.4和pH 9的Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分別為: (1.47±0.111) cm·s－1和(1.98±0.354) cm ·s－1; (4.23±0.229) cm·s－1和(5.24±0.550) cm·s－1; (3.01±0.262) cm·s－1和(3.77± 0.412) cm·s－1。在pH 7.4的環境下藥物的轉運量明顯大于pH 5(P＜0.01)和pH 9 (P＜0.05)。結果表明，IPHP在中性環境中吸收情況要優于在酸性和堿性條件下，這可能與IPHP的結構特點有關，其在中性環境中吸收更好。

Fig 4　Effect of pH on PappofIPHP across Caco-2 cell monolayers±s，n=3)

2.3.3溫度對IPHP轉運的影響溫度主要影響ATP依賴性轉運蛋白的活性，可能對IPHP在Caco-2細胞上的轉運產生一定的影響。因此本實驗將探討IPHP在4℃和37℃溫度條件下的吸收轉運情況，結果見Fig 5。由實驗結果可以看出，37℃條件下IPHP的Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BLAP) (×10－5)分別為［4.23±0.229］cm·s－1和(5.24±0.550) cm·s－1，而4℃條件下其Papp(AP－BL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分別為(3.21±0.626) cm·s－1和(4.17±0.354) cm· s－1。37℃環境下的AP到BL側和BL到AP側的滲透率均高于4℃環境(P＜0.05)，說明IPHP在Caco-2細胞上的轉運受溫度的影響，可能與相關ATP依賴性轉運蛋白有關。

Fig 5 Effect of temperature on PappofIPHP across Caco-2 cell monolayers±s，n=3)

Fig 6　Effect of transporter inhibitor on Pappof IPHP across Caco-2 cell monolayers (±s，n=3)

2.3.4抑制劑對藥物轉運的影響我們為了探討轉運蛋白的作用，加入了一系列的轉運蛋白抑制劑，如P-gp抑制劑維拉帕米、MRP2抑制劑MK-571和丙磺舒，來觀察轉運蛋?白對IPHP吸收轉運的影響，結果見Fig 6。實驗結果表明，當加?入P-gp抑制劑維拉帕米時，藥物滲透系數Papp(AP－BL) (× 10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)為(4.33±0.79) cm·s－1和(5.32±0.94) cm·s－1，相較于正常細胞組未發生明顯變化(P＞0.05)。而加入MRP2抑制劑MK-571和丙磺舒的組藥物滲透率Papp(APBL) (×10－5)和Papp(BL－AP) (×10－5)分別為(5.87±0.96) cm·s－1和(3.97±1.12) cm·s－1; (5.45±1.82) cm·s－1和(3.79±0.87) cm· s－1，由實驗數據可以看出，Papp(BL－AP) (×10－5)值均比Papp(AP－BL) (×10－5)值大，且相較于正常組，外排量明顯降低(P＜0.05)，吸收量明顯增加(P＜0.05)。說明加入抑制劑后，某些轉運蛋白受到了一定程度的抑制，導致外排量下降，吸收量增加。實驗結果表明IPHP在Caco-2細胞上的轉運可能與MRP2有關，而與P-gp無關。

3　討論

Caco-2細胞是人克隆結腸腺癌細胞，在適宜的培養條件下，將Caco-2細胞種在多孔的可滲透性聚碳酸酯膜上，經過21 d的融合分化可形成連續的單層。Caco-2細胞與人小腸上皮細胞在形態學上相似，具有相同的細胞極性和緊密連接;此外，Caco-2細胞含有與小腸刷狀緣上皮相似的轉運系統，例如外排蛋白P-gp、MRP2等［8－11］。因此，Caco-2細胞被廣泛應用于藥物的跨膜轉運實驗，用以預測藥物在人小腸的吸收的情況，較之體內的動物實驗具有簡單、方便、經濟等特點，更適合于藥物的高通量篩選。

本實驗采用Caco-2單層細胞模型，模擬IPHP在腸道的吸收情況，探討IPHP在腸道吸收的機制。MTT實驗篩選出合適的用于轉運的藥物濃度，在安全濃度范圍內進行轉運實驗，研究發現，IPHP在Caco-2細胞上的轉運具有濃度依賴性，且隨著濃度的增加其轉運量逐漸增加，說明IPHP的吸收可能以被動轉運為主。IPHP不同濃度從A側到B側的滲透系數Papp(AP－BL) (×10－5)分別為: (2.21± 0.200) cm·s－1，(3.56±0.306) cm·s－1，(3.81± 0.179) cm·s－1，(4.23±0.229) cm·s－1，(4.17± 0.262) cm·s－1，B側到A側的滲透系數Papp(BLAP) (×10－5)分別為: (3.57±0.209) cm·s－1，(4.51±0.113) cm·s－1，(4.97±0.229) cm·s－1，(5.24±0.550) cm·s－1，(5.07±0.557) cm·s－1，外排率分別為:1.61，1.26，1.30，1.23，1.21。在Caco-2細胞模型中藥物分子的表觀滲透系數與口服吸收相關聯。有文獻報道［12－13］，當藥物的表觀滲透系數大于1×10－6cm·s－1時，其表現出良好的吸收性。吸收較好藥物的表觀滲透系數在0.1～1× 10－6cm·s－1，而吸收差的藥物，其表觀滲透系數小于1×10－7cm·s－1。實驗結果表明，藥物IPHP的吸收良好，ER在0.5～1.5之間，差異不大，進一步說明IPHP的轉運方式主要是被動轉運。pH 7.4條件下IPHP的轉運量高于pH 5.0和pH 9.0，說明藥物在中性環境中的更容易被吸收，這可能與藥物IPHP的中性結構特點有關，IPHP結構中4位羰基與5位羥基易形成氫鍵，7位羥基和氨基容易形成氫鍵，3'位羥基與甲氧基的氧在空間結構上也容易形成5元環氫鍵，這些氫鍵都是分子內氫鍵，同時5，6元環比較穩定，使得分子趨于穩定，從而可能表現出中性的性質。藥物在中性狀態下溶解更加，更容易被吸收。IPHP在4℃時的轉運量相較于37℃明顯減少，說明溫度對IPHP的吸收是有影響的，可能與相關ATP依賴性轉運蛋白有關。加入了P-gp抑制劑維拉帕米后，IPHP的轉運量相較于正常組并無明顯差異，說明P-gp并未參與IPHP的轉運，而加入了MRP2抑制劑MK-571和丙磺舒的兩組，Papp(BL－AP)值相較于正常組明顯降低，Papp(APBL)值明顯增加。說明MRP2可能參與了IPHP在Caco-2細胞上的轉運，但是MK-571和丙磺舒并非專一性的MRP2抑制劑，其對BCRP等外排蛋白也有抑制作用，因此我們認為MRP2可能參與了IPHP的外排。

綜上所述，IPHP在Caco-2細胞模型上以被動轉運的吸收方式為主，同時可能有MRP2等相關外排蛋白介導其轉運，且具有較好的吸收特性。

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Transportation of 8-isopropylaminomethyl hesperitin(IPHP) across human intestinal epithelial by using Caco-2 cells

HU Ting-ting，HUANG Cheng，MENG Xiao-ming，CHEN Zhao-lin，SHEN Chen-lin，LI Jun
(School of Pharmacy，Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natural Products，Anhui Institute of Innovative Drugs，Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:AimTo study the mechanism of 8-isopropylaminomethyl hesperitin (IPHP) intestinal absorption using Caco-2 cell lines.Methods Using Caco-2 cell lines as an intestinal epithelial cell model，the effects of drug concentration，temperature，pH，P-glycoprotein (P-gp) inhibitor verapamil and multidrug resistance protein 2 (MRP2) inhibitors MK-571 or probenecid on IPHP transport across Caco-2 cell lines were all investigated.ResultsThe transportation of IPHP was related to drug concentration.The P(app)(APBL) (×10(－5)) was (2.21±0.200) cm·s(－1)，(3.56 ±0.306) cm·s(－1)，(3.81±0.179) cm·s(－1)，(4.23 ±0.229) cm·s(－1)，(4.17±0.262) cm·s(－1)，respectively，and P(app)(BL-AP) (×10(－5)) was (3.57± 0.209) cm·s(－1)，(4.51±0.113) cm·s(－1)，(4.97± 0.229) cm·s(－1)，(5.24±0.550) cm·s(－1)，(5.07± 0.557) cm·s(－1)，respectively.Efflux rate was 1.61，1.26，1.3，1.23，1.21，respectively.Temperature and pH both influenced the transport，While the P-gp inhibitor verapamil had no effect on the transport of IPHP.MRP2 inhibitors MK-571 or probenecid led to an apparent decrease in the efflux of IPHP.ConclusionThe results suggest that the transport of IPHP is mainly passive diffusion，and MRP2 but not P-gp may be involved in the transport of IPHP.

Key words:IPHP; Caco-2 cell; intestinal absorption; efflux; apparent permeability coefficients; passive diffusion;HPLC

作者簡介:胡婷婷(1988－)，女，碩士生，研究方向:生物藥劑學，E-mail: anhuihtt@ 163.com;李俊(1960－)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向:臨床藥理學、抗炎免疫藥理學、藥代動力學，E-mail: lj@ ahmu.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81273526) ;安徽省科技攻關項目(No 1301042212) ;安徽省自然科學基金資助項目(No 1206c0805026) ;安徽醫科大學博士科研啟動基金(No XJ201118)

收稿日期:2015－01－19，修回日期:2015－03－20

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0769－06中國圖書分類號: R284.1; R322.45; R329.24

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.007