同位素編碼衍生—高效液相色譜串聯質譜法測定果蔬樣品中的羧酸類植物生長調節劑

蔡軼平等

摘 要 以d0/d310甲基吖啶酮2磺酰哌嗪（d0/d3MASPz）為同位素編碼衍生試劑，建立了高效液相色譜串聯質譜（HPLCMS/MS）快速測定果蔬中6種羧酸類植物生長調節劑的分析方法。分別以d0MASPz（輕型）和d3MASPz（重型）為衍生樣品和對照品，混合后進行HPLCMS/MS分析。輕型和重型衍生物分別以[M+H]+ m/z 208.2和[M+H]+ m/z 211.2作為多級反應監測離子對，以重型衍生物作為相應輕型衍生物的內標物，建立定量分析方法。結果表明，在6.5 min內可實現6種分析物的完全分離，輕/重衍生物保留時間差異小于0.026 min， 6種分析物的輕/重信號強度比在10倍動態范圍內線性關系良好，相關系數r>0.9991，檢測限和定量限分別為0.19～0.34 μmol/L和0.53～0.96 μmol/L，相對標準偏差小于3.8%，標準加入的回收率為95.3%～105.5%之間。

關鍵詞 同位素編碼衍生； 高效液相色譜串聯質譜； 植物生長調節劑

1 引 言

內源性植物激素是一類由植物自身代謝產生，在極低濃度下發揮明顯生理效應的微量有機物質，影響植物的發芽、生根、開花、結實等生理活動[1]。在農業生產中，人們常使用一些結構和活性與內源性植物激素相似的化學物質作為低成本的替代品，用于調節植物生長和提高產量。為了規范這些外源性植物生長調節劑的應用，許多國家都制定了農產品中最小殘留限量標準[2]。利用高效液相色譜串聯質譜（HPLCMS/MS）可以同時實現多種植物生長調節劑的快速定量分析[3]。然而，基質效應嚴重影響HPLCMS/MS分析性能，難以獲得可靠的定量結果。以穩定同位素標記物做內標，可以有效克服基質效應的影響，但商售同位素內標物種類有限，價格昂貴。近年來，同位素編碼衍生技術備受關注，借助同位素編碼衍生試劑，使具有相同官能團的一類分析物同時獲得同位素衍生物，以此作為內標物進行定量分析，可以極大地降低同位素內標物的造價[4]。針對于胺基、醛基、羧基等官能團的同位素編碼衍生試劑均有報道[5]，但應用于羧酸類植物生長調節劑的研究還很少[6，7]。

本研究制備了一對新型同位素編碼衍生試劑d0/d310甲基吖啶酮2磺酰哌嗪（d0/d3MASPz），d0/d3MASPz以吖啶酮為母體，吖啶酮具有的分子內共振電離機制使得此試劑具有極強的質譜增敏作用[8]，此試劑以CH3/CD3為同位素編碼部件，3個H/D編碼原子既保證了低分辨質譜對輕/重信號的區分度，又能最大程度地減小色譜分離過程中的同位素效應。本研究以d0/d3MASPz為同位素編碼衍生試劑，建立了測定6種羧酸類植物生長調節劑的同位素內標定量方法，成功用于果蔬樣品中植物生長調節劑的快速、靈敏、準確測定。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1290型超高效液相色譜儀，6460型三重四級桿串聯質譜儀，配備電噴霧電離源（ESI），Masshunter工作站軟件（Agilent公司）。

d0MASPz（輕型）和d3MASPz（重型）由本實驗室自制；吲哚乙酸（IAA）、吲哚丙酸（IPA）、吲哚丁酸（IBA）、1萘乙酸（1NAA）、2萘乙酸（2NAA）、脫落酸（ABA），均購自Aladdin公司；乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；1乙基（3二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）等均為分析純。

2.2 d0/d3MASPz的制備

以本實驗自制的d0/d310甲基吖啶酮2磺酰氯（d0/d3MASC）[9]為原料制備d0/d3MASPz。具體步驟如下：稱取d0/d3MASC固體1 g溶于200 mL乙腈中，向其中加入30 mL水，1 g 哌嗪固體，60 ℃反應20 min。反應后旋蒸至干，水洗，抽濾，得黃色固體，用95%乙醇重結晶3次，純度大于99.9%。

2.3 溶液的配制

用乙腈配制1.0×10 3 mol/L植物生長調節劑標準儲備液，用乙腈稀釋至所需的濃度系列。稱取d0/d3MASPz固體0.0034 g，用乙腈溶解并定容至10 mL，濃度為1.0×10 3 mol/L；稱取EDC·HCl固體0.1 g，用乙腈溶解并定容至10 mL，濃度為5.0×10 2 mol/L。

2.4 同位素編碼衍生

取一支2 mL安瓿瓶，依次加入150 μL d0MASPz溶液、30 μL EDC溶液、25 μL植物生長調節劑標品，密封，在60 ℃水浴中反應60 min；另取一支2 mL安瓿瓶，采取同樣步驟，以d3MASPz衍生另一份標準品或樣品。兩份衍生液冷卻后混合，加入等體積水和硫酸銨固體（0.03 g）進行鹽析輔助萃取，取有機相0.5 μL進樣分析，衍生反應示意圖見圖1（A）。

2.5 色譜質譜條件

色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse C18色譜柱（50 mm ×2.1 mm， 1.8 μm），流動相A為95%乙腈（含0.1 %甲酸），流動相B為含0.1%甲酸的乙腈，流速：0.2 mL/min， 梯度洗脫程序：0 min （40% B）→6 min （60% B）→10 min （100% B）。

質譜條件：ESI電離源正離子模式，干燥氣溫度300 ℃，流速9 L/min，霧化氣壓力40 psi（278 kPa），鞘氣溫度250 ℃，流速8 L/min，毛細管電壓3.5 kV，碎裂電壓、碰撞能及MRM參數見表1。

3 結果與討論

3.1 質譜檢測及色譜分離

在2.5節所述的條件下，衍生物均顯示高豐度的[M+H]+信號和規則的MS/MS碎片，MS和MS/MS數據見表2，衍生物電離及裂解模式見圖1B。輕型衍生物主要產生m/z 208.2和224.2的碎片，重型衍生物主要產生m/z 211.2和227.2的碎片。以[M+H]+ m/z 208.2作為輕型衍生物的MRM監測離子，[M+H]+ m/z 211.2作為重型衍生物的MRM監測離子，輕型和重衍生物分離的離子流色譜圖見圖2A，各衍生物的保留時間見表1。結果表明，在6.5 min內可實現6種分析物的完全分離，輕/重衍生物保留時間差異小于0.026 min。endprint

3.2 衍生化方法評價

本實驗考察了衍生化方法的線性、靈敏度、精密度和準確度。濃度為1～1000 μmol/L的系列標準溶液經d0MASPz衍生后進行分析，結果表明， 各植物生長調節劑均具有良好的線性響應，相關系數均大于0.9955。檢出限（LOD， S/N= 3）和定量限（LOQ， S/N=10）分別在0.19～0.34 μmol/L和0.53～0.96 μmol/L范圍內。對10.0 μmol/L的標準品重復分析（n= 6），相對標準偏差小于3.8%。對5， 50和500 μmol/L濃度水平的標準品進行分析，準確度在97.5%～103.8%之間。結果表明，精密度和準確度良好，能夠滿足實際檢測需求。

3.3 同位素內標定量分析

定量分析模式參考文獻[10]，并通過兩種策略對內標定量法的可靠性進行評價。（1）用d0MASPz衍生3份濃度分別為5×10 5 mol/L， 2.5×10 5 mol/L和1.25×10 5 mol/L的標準品，同時使用d3MASPz衍生3份濃度均為2.5×10 5 mol/L標準品，將輕/重衍液按體積比1∶1混合，對3份混合液進行分析。結果表明，在以上3個比率水平上，6種植物生長調節劑的輕/重衍生物質譜信號強度比均接近理論值（見圖3A）；（2）兩份濃度為2.5×10 5 mol/L的植物生長調節劑標準品，分別用d0MASPz 和d3MASPz進行同位素編碼衍生，將兩份衍生液按照體積比1∶10， 1∶5， 1∶2， 1∶1， 2∶1， 5∶1和10∶1混合后分析，以輕/重衍生物質譜信號強度之比對體積比做校正曲線，6種分析物線性良好，相關系數r≥ 0.9991，曲線斜率在0.9923～1.0647之間（圖3B）。以上數據表明，本實驗建立的基于同位素編碼衍生的內標定量方法可實現6種植物生長調節劑的快速準確測定，以斜率作為輕/重衍生物質譜響應的相對校正因子，可以方便地實現樣品中分析物的絕對定量分析。

3.4 實際樣品分析

市場購得黃瓜、西紅柿樣品，根據文獻[11]的方法提取植物生長調節劑，提取液按2.4節方法進行同位素編碼衍生后，進行HPLCMS/MS分析。典型樣品MRM色譜圖見圖2B，測得各植物生長調節劑的含量見表2。西紅柿樣品中吲哚乙酸、吲哚丁酸植物生長素含量較高，黃瓜樣品中萘乙酸殘留量較高。向樣品中添加標準對照品，測得方法回收率在95.3%～105.5%之間。本方法快速、準確，滿足測定果蔬樣品中植物生長調節劑殘留的要求，可為規范植物生長調節劑的使用提供技術支持。

References

1 ZHOU YanMing， XIN Xue. Food Science， 2010， 31（18）： 301-304

周艷明， 忻 雪. 食品科學， 2010， 31（18）： 301-304

2 Chen H， Zhang Z X， Zhang G M， Guo X F， Zhang H S， Wang H. J. Agr. Food Chem.， 2010， 58（8）： 4560-4564

3 Bai Y， Zhang J， Liu H. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 403（8）： 2307-2314

4 OUYANG Yue， SUN XiaoHong， YAN Jing， CHU JinFang， YAN CunYu. Chin. Sci. Bull. （Chin. Ver.）， 2013， 58（7）： 2762-2778

歐陽玥， 孫曉紅， 閆 靜， 褚金芳， 閆存玉. 科學通報， 2013， 58（7）： 2762-2778

5 Sun Z， Sun H， Li H.， You J， Xia L. Curr. Anal. Chem.， 2014， 10（3）： 381-392

6 Huang Y Q， Liu J Q， Gong H， Yang J， Li Y， Feng Y Q. Analyst ， 2011， 136（7）： 1515-1522

7 Sun X， Ouyang Y， Chu J， Yan J， Yu Y， Li X， Yang J， Yan C. J. Chromatogr. A， 2014， 1338： 67-76

8 ZHAO HuaiXin， SUN XueJun， SUN ZhiWei， HU BaoJun， LIU QinZe， ZHAO XinQuan， YOU JinMao. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（2）： 187-193

趙懷鑫， 孫學軍， 孫志偉， 戶寶軍， 劉欽澤， 趙新全， 尤進茂. 分析化學， 2009， 37（2）： 187-193

9 Zhang S， You J， Ning S， Suo Y， Song C. J. Chromatogr. A， 2013， 1280： 84-91

10 Dai W， Huang Q， Yin P， Li J， Zhou J， Kong H， Zhao C， Lu X， Xu G. Anal. Chem.， 2012， 84（23）： 10245-10251

11 ZENG QingQian， CHEN HouBin， LU CaiHao， LI JianGuo. Journal of Fruit Science， 2006， 23： 145-148

曾慶錢， 陳厚彬， 魯才浩， 李建國. 果樹學報， 2006， 23（1）： 145-148

Abstract A method for determination of 6 plant growth regulators by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） coupled with isotopecoded derivatization was developed. d010Methylacridone2sulfonyl piperazine （d0MASPz， light form） and d310methylacridone2sulfonyl piperazine （d3MASPz， heavy form） were prepared as isotopecoded derivatization reagents for carboxyl compound. The carboxyl plant growth regulator standards and real samples were derivatized by d0MASPz and d3MASPz， respectively. The obtained solutions were mixed at a certain ratio， and then injected for HPLCMS/MS analysis. The light and heavy derivatives were monitored with transitions of [M+H]+ m/z 208.2 and [M+H]+ m/z 211.2，respectively. With heavy derivative as internal standard for corresponding light derivative， the global isotope internal standard quantification for 6 plant growth regulators was achieved. The results indicated that the proposed isotopecoded derivatization method could provide relative quantitative data with adequate linearity in a 10fold dynamic range （R=0.9991）. The detection and quantitation limits were 0.19-0.34 μmol/L and 0.53-0.96 μmol/L， respectively. The relative standard deviations were ≤3.8%， and the accuracies ranged from 97.5% to 103.8%.

Keywords Isotopecoded derivatization； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Plant growth regulators

（Received 6 October 2014； accepted 24 December 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21305076， 31300292） and the Natural Science Foundation of Shandong Province， China （No. ZR2012BQ022）endprint