泡核桃殼提取物體外抗腫瘤作用研究

劉成嬌，夏盟愷，李 楊，王 瑩

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

漾濞泡核桃（Juglans sigillata）別名漾濞核桃、茶核桃、鐵核桃，主要分布于云南、貴州、四川西部、西藏及雅魯藏布江下游等地〔1〕。《中藥大辭典》中記載核桃楸皮和核桃楸果具有清熱、解毒、明目和止痛等功效〔2〕。藥理活性研究表明胡桃楸的不同部位，包括莖枝、皮、根、葉和核桃青皮的提取物均具有抗腫瘤作用〔3-6〕。而對于核桃成熟果實內皮（核桃殼）的抗腫瘤作用研究較少。云南省大理州漾濞縣為核桃之鄉，大量種植泡核桃。在核桃仁的深加工中，被廢棄的核桃殼大部分被用作農戶燃料，造成了資源的極大浪費。本研究觀察了泡核桃殼提取組分對3株腫瘤細胞的抑制作用，從而為今后泡核桃殼藥用價值的開發提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 RPMI-1640、新生牛血清、MTT、PBS購于Beijing solarbio science&technology co.ltd；順鉑（Cisplatin，DDP）購自云南生物谷燈盞花藥業有限公司；青霉素、鏈霉素購自河南新鄉華星藥廠；二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽為Amresco公司生產。

1.1.2 細胞株 人卵巢癌細胞SKOV-3、人肝癌細胞HepG-2、人胃癌細胞MGC-803均由中國科學院昆明動物研究所提供。

1.2 儀器 BB16UV/BB5060UV型CO2培養箱為德國Heraeus公司生產；IX-7型倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司生產；IX-31型光學生物顯微鏡為日本Olympus公司生產；連續波長酶標儀為BIOTek公司生產；METFLERAE240型電子分析天平為梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司生產；1.0R型低溫高速離心機為德國Heraeus公司生產。

2 方法

2.1 抗腫瘤活性成分的分離提取 泡核桃殼經10%NaOH浸泡24 h后，用冰醋酸調pH為中性，加2、4、6倍乙醇沉淀得到HTKD（D）、HTKE（E）、HTKF（F）提取物，所占生藥百分率分別為7.55%、3.34%和1.32%，精密稱取D、E、F組分，用無血清培養基RPMI-1640配制成濃度為300μg/mL的原液，0.2μm微孔濾膜過濾除菌，再倍比稀釋成150、75、37.5、18.75 μg/mL藥液待用。

2.2 陽性對照藥物的配制 陽性藥選用DDP，取1 mg/mL的DDP溶于無血清的RPMI-1640中，5倍稀釋，終濃度分別為 50、10、2、0.4 μg/mL。

2.3 體外細胞的培養 SKOV-3、HepG-2和MGC-803均用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基在37℃、5%CO2條件下培養，取對數生長期細胞用于實驗。

2.4 改良MTT法測3種不同提取物對癌細胞的影響 取對數生長期的腫瘤細胞（SKOV-3、HepG-2、MGC-803），將貼壁細胞濃度調整為6×104個/mL，以90μL/孔種入96孔培養板中。同時設立空白組、陰性對照組及陽性對照組（DDP），每組至少設5個復孔。置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h，受試組分別加入10μL不同濃度的樣品。加藥后將96孔板置37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，棄培養液，PBS洗板3次，再加90μL含5%血清RPMI-1640培養液，同時每孔加10μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續培養4 h后，棄去培養液，每孔加100μL DMSO溶解，570 nm波長下測定吸光度值（OD）。

2.5 數據處理 計算核桃殼3個組分在不同測試濃度下OD值的均數及標準差，并用下述公式計算細胞的抑制率。細胞抑制率=（對照組OD值-給藥組OD值）/對照組OD值×100%，細胞的半數抑制濃度（IC50）值由GWBASIC軟件計算得到。SPSS分析量效相關系數。

3 結果

3.1 核桃殼提取物對3株腫瘤細胞作用24 h時的半數抑制濃度 與陽性對照藥順鉑相比較，核桃殼提取物 D、E、F對腫瘤細胞SKOV-3、HepG-2 和MGC-803均有一定的抑制作用，但作用較弱，IC50值均遠遠大于陽性藥，差異有統計學意義（P＜0.01），其中提取物D對HepG-2的作用呈雙向性，因而未能求得IC50值。在3個組分中核桃殼提取物E對3株腫瘤細胞的IC50值均最小。見表1。

表1 核桃殼提取物D、E、F對3株腫瘤細胞作用24 h時的IC50（±s）

表1 核桃殼提取物D、E、F對3株腫瘤細胞作用24 h時的IC50（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

提取物DDP HTKD HTKE HTKF MGC-803 1.611±0.207 203.119±42.308**125.175±35.200**175.247±23.196**SKOV-3 4.727±0.675 219.712±32.342**147.520±20.336**427.881±60.465**IC50 HepG-2 1.972±0.295—227.163±32.691**342.622±59.747**

3.2 核桃殼提取物對3株人癌細胞作用的量效關系分析 圖1～3顯示了各組分抑瘤作用的量效關系。作用24 h后，各組分對腫瘤細胞的抑制作用均呈現出良好的劑量依賴性（除了組分D對HepG-2的作用），量效相關系數見表2；隨著組分D、E、F濃度的增加，抑制率亦增加。在高濃度（300μg/mL）下，組分E對3株癌細胞的抑制作用優于D和F，對癌細胞的抑制率超過60%。見圖1～3。組分D在較低濃度對肝癌細胞HepG-2不僅沒有抑制作用，反而表現出促進細胞生長的作用，濃度在75μg/mL時其促生長作用最明顯。

表2 核桃殼提取物對3株人癌細胞作用的量效相關系數

圖1 核桃殼提取物D、E和F對SKOV-3細胞增殖的抑制作用

圖2 核桃殼提取物D、E和F對HepG-2細胞增殖的抑制作用

圖3 核桃殼提取物D、E和F對MGC-803細胞增殖的抑制作用

4 結論

實驗結果表明，從泡核桃殼中提取得到的3個組分對于不同癌細胞體外增殖均有一定抑制作用，但作用明顯弱于陽性對照藥順鉑，這可能是由于供試藥品均是天然植物藥的粗提物，有效成分含量較少所致，另外從組分D對HepG-2的雙向作用來看，也可能因為供試藥品中抑制和促進腫瘤生長的物質混合存在，因而影響了作用效果。其中組分E對3種癌細胞體外抑制作用較D和F強。E在高濃度（300 μg/mL）時，對3株人卵巢癌細胞SKOV-3、肝癌細胞HepG-2和人胃癌細胞MGC-803的抑制率分別達到了61.83%、62.83%和81.47%，組分E的IC50值也均小于D和F，提示主要藥效物質可能存在于組分E中。

提取物D對HepG-2的作用呈雙向性，高濃度（300μg/mL）具有抑制作用，當濃度小于150μg/mL時又表現出促進腫瘤生長的作用，周孟清等〔6〕也發現，核桃殼提取物小劑量對小鼠免疫功能有促進作用，大劑量作用反而不明顯。這可能是因為天然植物藥藥效物質復雜、存在某些藥效作用相反的成分所致。天然植物藥的研究與開發，在資源、能源危機已日益突出的今天，具有廣闊的前景和深遠的意義。本實驗對泡核桃殼的抗癌作用進行初步研究，為其在藥效價值的開發利用上奠定實驗基礎。

〔1〕李寅珊，劉光明，李冬梅.GC-MS法鑒定漾濞泡核桃殼中揮發性化學成分〔J〕.安徽農業科學，2011，39（25）:1527-1528.

〔2〕江蘇新醫學院.中藥大辭典：下冊〔M〕.上海：上海人民出版社，1977：1663.

〔3〕文姝，張紅梅，金禮吉，等.胡桃楸提取液誘導Hela細胞凋亡的研究〔J〕.中國微生態學雜志，2002，14（2）：81-82.

〔4〕季宇彬，汲晨鋒，馬宏圖.青龍衣冷、熱乙醇提取物對H22小鼠腫瘤細胞膜生化功能影響的研究〔J〕.中國中藥雜志，2005，30（7）：531.

〔5〕周萍，許興景，王敏，等.泡核桃殼棕色素的提取和穩定性研究〔J〕.安徽農業科學，2011，39（7）:3912-3913.

〔6〕周孟清，謝申伍，呂治鋼，等.薄皮核桃殼醌類物質微波輔助提取及初步小鼠試驗〔J〕.飼料工業，2013，34（21）:20-23.