黑腹果蠅線粒體轉錄終止因子DmTTF蛋白的生物信息學分析

熊 偉，張曉娟 ，左紹遠，張海洋，馮慕華

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000；3.大理市第一人民醫院，云南大理 671000）

黑腹果蠅Drosophila melanogaster，也稱黑尾果蠅，是被人類研究得最徹底的生物之一。其名字源于它喜好腐爛的水果以及發酵的果汁。黑腹果蠅是一種原產于熱帶或亞熱帶的蠅種，易于培養，繁殖快，室溫條件下，10 d就可以繁殖一代，使用經濟，且只有4對染色體，易于遺傳操作，有很多突變體可以利用，是遺傳、發育、生理和行為等的研究方面最常見的研究對象之一。

線粒體轉錄終止因子（Mitochondrial Transcription Termination Factor，MTERF）是一類存在于多細胞生物中的高度保守的線粒體DNA結合蛋白，具有相似的亮氨酸拉鏈結構〔1〕。MTERF蛋白家族不僅在脊椎動物中存在，在昆蟲、蠕蟲等無脊椎動物中也存在，但目前在真菌中仍未發現與其同源的蛋白質〔1〕。黑腹果蠅線粒體轉錄終止因子（Drosophila melanogasterMitochondrial Transcription Termination Factor，DmTTF）是在無脊椎動物中克隆到的第一個MTERF蛋白超家族成員，分析和研究DmTTF有助于更好地理解黑腹果蠅線粒體基因轉錄過程和調控機制〔2〕。

黑腹果蠅屬于雙翅目，果蠅科。由于繁殖能力強的特點，黑腹果蠅經常被當做生命科學和醫學研究的模式物種。到目前為止，對DmTTF的生物學研究已經有一定的進展，但是對其生物信息學分析還未見報道。為此，本研究采用生物信息學方法，對DmTTF的理化性質、親水性/疏水性、保守結構域、二級結構、三級結構、蛋白質-蛋白質相互作用、與其它物種親緣關系等方面進行預測和分析，為其后續研究奠定全面的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 數據資料來源于FlyBase網站已經注冊的黑腹果蠅線粒體轉錄終止因子DmTTF序列。黑腹果蠅CG18124基因編碼DmTTF蛋白，其中mRNA序列登陸號為NM_135865.4，蛋白質序列登陸號為NP_609709.1。1.2 方法 利用ProtParam分析蛋白質理化性質；利用ProtScale分析蛋白質親水性/疏水性；利用TMHMM分析蛋白質的跨膜區〔3〕；蛋白序列同源性、多序列比對及序列系統進化樹分別由NCBI protein blast、ClustalX2.0、njplot等軟件實現；利用PSORT II Server和Loctree預測蛋白質亞細胞定位；利用Smart在線軟件和NCBI Conserved Domains數據庫來分析保守區域〔4〕；Jpred和Swiss-Model分別預測蛋白質二級結構和三級結構；String則用來預測蛋白質的相互作用〔5〕。各數據庫和軟件的相關信息如表1。

表1 預測蛋白質結構和功能應用的網站及軟件

2 結果與分析

2.1 DmTTF蛋白的理化性質預測和分析 使用ProtParam蛋白質理化性質預測網站對DmTTF蛋白進行理化性質預測。結果顯示，黑腹果蠅CG18124基因編碼的DmTTF蛋白質為410個氨基酸，含量最多的氨基酸為亮氨酸和精氨酸；蛋白質分子式C2148H3459N617O607S20，理論分子質量為48 281.0，理論等電點為9.62，說明DmTTF是堿性蛋白質；DmTTF蛋白的半衰期均達到了30 h；DmTTF蛋白的不穩定系數大于40，表明它不是穩定蛋白；脂肪系數為90.78，平均親水系數（GRAVY）為-0.466，表明它是親水性蛋白質。

2.2 DmTTF蛋白親水性/疏水性預測和分析 利用蛋白質親水性/疏水性在線預測工具ProtScale對DmTTF進行親水性/疏水性分析（圖1）。結果顯示，DmTTF親水性最強位點出現在67位，分值為-2.800，這個位點的氨基酸是谷氨酸（glutamic acid，E）；DmTTF疏水性最強位點出現在161位，分值為1.644，這個位置的氨基酸是亮氨酸（leucine，L）。ProtScale的預測結果顯示DmTTF的親水肽鏈分布在整個氨基酸序列中，且明顯多于疏水肽鏈，預測結果也證明它是一種水溶性蛋白質。

圖1 DmTTF蛋白親水性/疏水性分析（采用Kyte&Doolittle方法）

2.3 DmTTF蛋白的亞細胞定位分析 通過PSORT II工具預測DmTTF蛋白的亞細胞定位，結果表明DmTTF蛋白分布于線粒體、細胞核、細胞質和細胞骨架的可能性分別為56.5%、26.1%、13.0%和4.3%。Loctree在線軟件預測結果表明該蛋白質定位于線粒體，所以DmTTF蛋白可能定位于線粒體中發揮作用。

2.4 DmTTF蛋白跨膜區預測和分析 使用在線蛋白質跨膜區分析工具TMHMM軟件對DmTTF進行跨膜區分析，見圖2。結果顯示，DmTTF不含跨膜區，說明DmTTF不是跨膜蛋白質。MTERF蛋白家族是在線粒體DNA轉錄調控過程中發揮作用，屬于線粒體定位，而非膜蛋白，預測結果與這一描述相符。

圖2 DmTTF蛋白跨膜區預測

2.5 DmTTF蛋白的二級結構預測和分析 蛋白質的二級結構包括等結構組件，對其預測和分析有助于認識蛋白質的空間結構。Jpred軟件由Barton Group創建于1998年，目前最新版本為3.0。Jpred采用Jnnet神經網絡算法來預測蛋白質二級結構，平均準確率大于81%〔5〕。采用Jpred在線預測軟件對DmTTF的二級結構進行預測，結果顯示，DmTTF含有大量α-螺旋區和1個β-折疊區。無規則卷曲和β-折疊區氨基酸比率分別占到48.91%和0.80%，說明DmTTF大部分氨基酸（50.29%）處于α-螺旋狀態。

2.6 DmTTF蛋白的保守結構域預測和分析 使用Smart在線軟件對DmTTF進行保守結構域分析。結果表明DmTTF屬于線粒體轉錄終止因子（MTERF）蛋白超家族，含有3個保守的Mterf結構域，分別位于122-152、314-345、346-376位氨基酸，此結構域由大約30個氨基酸組成，其中氨基酸序列同源性高，并且此保守結構域與NCBI提供的蛋白質保守結構域分析數據庫（Conserved domains database）預測的保守區位置基本一致。

2.7 DmTTF蛋白的三級結構預測和分析 蛋白質三級結構預測與分析對了解蛋白質的結構與功能之間的相關性至關重要，也對理解該蛋白質與其他分子的相互作用機理及位點大有幫助。Swiss-Model是一款采用同源建模的方法預測蛋白質三級結構的在線軟件，此外它還能夠預測蛋白質電荷分布、原子間距離和角度等。將DmTTF蛋白的氨基酸序列提交到Swiss-Model，網站給出了預測結果，如圖3。結果顯示，DmTTF蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲構成，且與二級結構預測結果基本一致。模型評估使用全局法中的QMEANscore4計分值估算，模板（3mvb.1.A）序列建模方法使用X-ray，分辨率為2.79 ?，比對的范圍在73～295aa，覆蓋度達到74.0%，分析結果表明預測模型趨近于真實情況。

圖3 DmTTF蛋白三級結構預測

2.8 DmTTF相互作用蛋白預測和分析 使用String 10.0蛋白質相互作用預測網站對DmTTF進行蛋白質相互作用預測，結果如圖4。

圖4 DmTTF蛋白相互作用預測

與DmTTF相互作用最緊密的10個蛋白質及預測結果得分（可靠性）見表2。結果顯示，與DmTTF相互作用最緊密的10個蛋白質均為線粒體DNA轉錄因子或線粒體基因組的組成部分，這與DmTTF參與線粒體基因轉錄調控的事實相符合。

表2 10種最可能與DmTTF相互作用的蛋白質

2.9 DmTTF蛋白的同源性預測和系統進化樹分析使用Protein Blast軟件對DmTTF蛋白進行同源性分析，數據顯示，家蠅Musca demestica、弓背蟻Camponotus flondanus、達氏按蚊Anopheles darlingi、大猩猩Gorilla gorilla gorilla、智人Homo sapiens的線粒體轉錄終止因子與DmTTF進行比較時，比對序列覆蓋范圍（Query cover）分別是100%、80%、73%、21%、21%；在此基礎上的序列相似性（Identity）分別是54%、24%、41%、32%、30%。利用ClustalX2.1程序對DmTTF于上述物種同源的蛋白序列進行多重比對，進一步使用niprot軟件對ClustalX2.1比對結果產生的系統進化樹進行可視化分析，結果如圖5。結果顯示，DmTTF蛋白與家蠅同源蛋白之間進化距離最小，其次是達氏按蚊，與人和大猩猩的進化關系相對較遠。另外，人和大猩猩的線粒體轉錄終止因子蛋白聚為一類，它們之間的進化距離最小。

圖5 蛋白質系統進化樹

3 討論

線粒體轉錄終止因子蛋白主要在線粒體DNA的轉錄起始和轉錄終止階段發揮作用，一方面它能與其它線粒體轉錄因子相互作用形成轉錄起始復合物〔6-7〕；另一方面它還能終止線粒體基因組的轉錄過程〔8-9〕。由于黑腹果蠅繁殖能力強、養殖費用低、突變體多等特點，果蠅被認定為是生命科學和醫學研究的理想生物模型〔10〕。

本研究主要從生物信息學角度解析了黑腹果蠅線粒體轉錄終止因子DmTTF的部分信息。經研究發現，DmTTF蛋白全長410個氨基酸，屬于線粒體轉錄終止因子蛋白超家族，不含跨膜區和信號肽序列，蛋白質亞定位于細胞線粒體。通過Smart軟件預測DmTTF蛋白含有3個保守的Mterf基序，每個基序由大約30個氨基酸殘基構成。進一步分析DmTTF的二級結構和三級結構，兩種分析結果中α-螺旋和β-折疊的數量及出現位置基本一致，說明建模結果可靠，分析結果有助于闡明DmTTF與其他轉錄因子相互作用的空間結構基礎。在研究DmTTF與其他蛋白的相互作用結果中，發現與DmTTF相互作用的蛋白均為線粒體轉錄因子和線粒體呼吸鏈蛋白〔11-12〕，其預測結果有文獻和數據庫兩方面的證據，結果真實可靠。通過多重序列比對及構建蛋白質系統進化樹發現，DmTTF蛋白與家蠅同源蛋白質的序列相似性最高，且兩者之間的進化距離最近，說明該蛋白質的分子進化與物種的進化是一致的。

本研究的分析結果對于深入研究DmTTF蛋白在線粒體基因轉錄過程中的作用及其調控機制具有一定的指導意義。

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