水中白骨化尸體的DNA檢驗

張自雄，胡麗梅，向峰，鄒軍根

（巴中市公安局物證鑒定所，四川巴中 636000）

·經驗交流·

水中白骨化尸體的DNA檢驗

張自雄，胡麗梅，向峰，鄒軍根

（巴中市公安局物證鑒定所，四川巴中 636000）

法醫遺傳學；磁珠法；硅膜法；股骨；牙齒

白骨化尸體的身源鑒定往往是法醫學鑒定的難點之一。通常選用長骨、牙齒作為檢材，然而對于水中浸泡的白骨化尸體則增加了DNA檢驗的難度，如何建立穩定、有效的檢驗方法具有重要意義。本研究就本實驗室近年來對在水中浸泡后形成的50例白骨化尸體的DNA檢驗，總結經驗，介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

各類案件發現的水中白骨化尸體50例，共取得股骨50根、牙齒50枚。

1.2 方法

1.2.1 預處理

取股骨干一段，沙紙反復擦拭去除表面污垢，5%次氯酸鈉溶液清洗表面，蒸餾水清洗3～6次，無水乙醇沖洗一次，晾干，最后紫外光照射。

取送檢牙齒，用蒸餾水浸泡清洗表面，并用棉簽、刀片等除去牙齒表層污垢，加入5%次氯酸鈉浸泡10min左右，棄廢液，蒸餾水泡洗3～5次，95%乙醇溶液浸泡1 h，用濾紙吸干，以紫外線消毒牙齒各面各15min。

1.2.2 裂解

將牙齒用簡易砸牙器砸成牙齒粉末，用電鉆鉆取股骨干部位制成骨粉，分別置于1.5mL離心管中，加入0.5mol/L脫鈣液（EDTA），振蕩后放于37℃水浴箱脫鈣24h，隔12h離心，更換EDTA。脫鈣完成后，以離心半徑5cm，13000r/min，離心5min，棄去上清液，牙齒粉末中加入300 μL骨骼裂解液、30 μL DTT溶液（1 mol/L）以及30 μL PK溶液（20 mg/μL），56℃消化12 h，消化完全后，以離心半徑5 cm，13 000 r/min，離心5min，將上清液移至新1.5mL離心管中進行純化。

1.2.3 純化

取以上上清液各一半分別采用硅膜法（QIAquick純化試劑盒，德國QIAGEN公司）和磁珠法（DNA IQ試劑盒，美國Promega公司）試劑進行DNA純化。

硅膜法純化步驟：（1）將上清液與體積相同的V氯仿/V異戊醇=24∶1混勻，以離心半徑5cm，13000r/min，離心5min，吸取上層水相至5mL試管中。（2）用純化試劑盒中的PBI試劑與上清液按5∶1體積振蕩混勻，然后向純化柱中加入適量混合液，以離心半徑5cm，13000r/min，離心1min，重復操作直到混合液全部過濾。（3）加300μL PBI試劑離心并洗滌1次，加入已配制的洗滌液（PE），離心并洗滌3次，再以離心半徑5 cm，13 000 r/min，離心1 min，將純化柱放到新的1.5mL微量離心管上，打開蓋子于室溫中揮發5min。（4）將洗脫液（EB）20 μL加入純化柱的硅膜中心，65℃恒溫5 min，以離心半徑5 cm，13 000 r/min，離心1 min，收集微量離心管內液體用于PCR反應或置于4℃，保存備用。

磁珠法純化步驟：（1）取適量液體樣品放入1.5mL離心管中，加入2倍體積配制好的裂解液（內含1μL 1mol/L DTT）和7μL磁珠，旋渦振蕩使磁珠懸浮，室溫放置5min。（2）旋渦振蕩后將離心管放在磁架上，小心吸去液體。（3）用100μL裂解液洗滌一次，旋渦振蕩使磁珠懸浮，將離心管放在磁架上，小心吸去液體。（4）用100μL洗液洗滌3次，每次旋渦振蕩使磁珠充分懸浮。（5）打開離心管蓋，室溫下空氣干燥5～10min。（6）加入30μL的EB洗脫液，蓋好蓋子，65℃加熱5min。（7）從水浴中取出離心管，立即用旋渦振蕩器振蕩離心管，待磁珠懸浮后，立即將離心管放回磁架上。（8）小心將DNA溶液吸到干凈離心管中用于PCR擴增或置于4℃冰箱保存。

1.2.4 PCR擴增和電泳檢測

采用Identifiler試劑盒（美國AB公司）擴增，操作按照儀器及試劑使用說明書進行。

擴增后用3130XL遺傳分析儀（美國AB公司）進行電泳檢測，GeneMapper v3.2軟件分析結果。

2 結果與討論

在50例送檢檢材中，對股骨采用硅膜法純化獲得STR分型46例，采用磁珠法純化獲得STR分型42例。牙齒采用硅膜法純化獲得STR分型50例，采用磁珠法純化獲得STR分型47例。經與失蹤人員親屬DNA STR分型比對，均符合生物學遺傳關系。

通過對水中白骨化尸體長骨、牙齒的DNA檢驗，筆者認為牙齒DNA檢驗效果優于長骨。雖然牙齒和長骨內的DNA分子保存均較長，但是牙齒有3種堅硬的礦化組織保護，因此對于時間和外界環境（如水）有較強抵抗力，而長骨正是缺少這樣一種特殊的保護，其DNA分子往往受到破壞而降解。因此條件允許的情況下，對于白骨化尸體，DNA檢驗時選擇牙齒檢材要優于長骨。同時選擇的牙齒要保證其完整性，優先選擇磨牙。在選擇純化試劑盒的方面，本實驗室在純化過程中分別采用了磁珠純化法和硅膜純化法進行結果比較，發現硅膜法純化法優于磁珠純化法，分析其原因可能為硅膜可通過控制孔徑選擇性地濾過DNA分子，達到最佳純化目的。

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.017

1004-5619（2015）02-0147-01

2014-09-24）

（本文編輯：李成濤）

張自雄（1979—），男，四川巴中人，主檢法醫師，主

要從事法醫物證學檢驗工作；E-mail：37788913＠qq.com