果汁中維生素C熒光法測定的實驗設計與教學探索

黃方志， 沈玉華， 李士闊， 謝安建

(安徽大學 化學化工學院， 安徽 合肥 230039)

?

果汁中維生素C熒光法測定的實驗設計與教學探索

黃方志， 沈玉華， 李士闊， 謝安建

(安徽大學 化學化工學院， 安徽 合肥 230039)

通過果汁中維生素C的熒光法測定實驗，學生不僅能掌握正交設計法以及樣品前處理方法，還能更好地理解和掌握熒光的分析原理、操作方法、定性、定量方法及其在化合物檢測分析研究中的重要性。經(jīng)過幾年的教學實踐、探索與完善，教學成效已初步顯現(xiàn)。

熒光分光光度法； 化學綜合實驗； 實驗教學； 創(chuàng)造性思維

0 引 言

維生素C在人體內(nèi)不能合成, 只能從食物和藥物中攝取，因此, 食品、藥物中維生素C的分析與測定具有重要意義[1-9]。在Deutsch和Weeks報道的維生素C 的經(jīng)典熒光分析檢測法(OPDA)的基礎上，結(jié)合正交實驗設計，構(gòu)建了一例簡便易行、結(jié)果明顯、樣品處理簡單、快速,體系穩(wěn)定性好，并能與分析化學理論知識緊密結(jié)合的化學綜合實驗。本實驗以日常生活中常見的飲品為原料，貼近生活，激發(fā)了學生的實驗激情與主動性。將經(jīng)典的熒光分析法與正交設計結(jié)合起來，使學生在掌握熒光分析法基礎知識和基本技能的同時，培養(yǎng)他們的創(chuàng)新思維。

化學綜合實驗是針對分析化學專業(yè)高年級本科生開設的，在本科畢業(yè)論文開始之前，設計6個化學綜合實驗，通過幾個典型的綜合實驗教學，使學生系統(tǒng)地掌握分析化學專業(yè)綜合知識，達到對知識的融會貫通。共安排48學時，一個班分成6個大組，每大組分成4個小組，每小組2或1人，其中熒光分析儀器有2臺，實驗采用循環(huán)模式。整個實驗教學過程包括，引導學生如何完善具體的實驗方案以及實現(xiàn)對樣品的前處理；借助正交設計實驗在有限的時間內(nèi)完成樣品測試最佳實驗條件的確定；各種試劑的配制；試樣的處理與測試機理以及影響測試結(jié)果的因素、定性定量方法等。

1 實驗內(nèi)容

1.1 實驗目的

了解樣品前處理的方法，掌握分子熒光分析法的基本原理及其儀器組成，掌握正交設計的基本方法及應用，熟悉熒光法測定食品中維生素C含量的方法。

1.2 實驗原理

熒光是物質(zhì)吸收光的能量后產(chǎn)生的，因此任何熒光物質(zhì)都具有兩種光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

維生素C本身無明顯的熒光效應，因此，需要預先處理。維生素C先被活性炭(Norit)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，DHAA再與熒光底物鄰苯二胺(OPDA)結(jié)合生成熒光產(chǎn)物，通過對該熒光產(chǎn)物的檢測實現(xiàn)對維生素C的定量分析[10]。進一步，采用十六烷基三甲基溴化銨產(chǎn)生熒光協(xié)同增敏作用[11]。

1.3 儀器與試劑

F-2500熒光分光光度計；FA2004A電子分析天平。 PHS-3CT精密酸度計；乙酸鈉溶液(5 g/L，25 g/L，100 g/L)；活性碳；鄰苯二胺溶液(2 g/L)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液(6.0×10-4g/mL)；偏磷酸-冰醋酸-硫酸溶液：稱取15g偏磷酸，加入40 mL冰醋酸，用0.015 mol/L 硫酸稀釋至500 mL；硼酸-乙酸鈉溶液：稱取硼酸9 g，加入35 mL乙酸鈉溶液，用水稀釋至1 000 mL(使用前配制)；抗壞血酸標準溶液：準確稱取0.500 g抗壞血酸溶于偏磷酸-冰醋酸溶液中，定容至500 mL容量瓶中，此標準溶液濃度為每毫升相當于1 mg的抗壞血酸(新鮮配制)；吸取上述溶液5 mL，再用偏磷酸-冰醋酸溶液定容至50 mL，此溶液每毫升相當于0.1 mg的抗壞血酸標準溶液(新鮮配制)；維生素C樣品：果珍或橙汁；實驗所用試劑均為分析純；實驗用水均為二次蒸餾水。

1.4 實驗步驟

1.4.1 維生素C標準溶液的測試

將制備好的50 mL標準溶液(含抗壞血酸0.1 mg/mL)倒入燒杯中，加1～2 g活性炭搖勻1 min，過濾。取50 mL容量瓶1只，準確移取剛處理過的溶液1.0 mL，再加入20 mL硼酸-乙酸鈉溶液，用水定容至刻度，得到0.002 mg/mL 抗壞血酸/乙酸鈉溶液，此液作為標準空白溶液，測定熒光強度作為試劑空白(F0)。再取10 mL帶刻度的試管，吸取0.5 mL 上述溶液，用蒸餾水定容至3.0 mL；在避光的環(huán)境中，迅速向各管中加入5 mL鄰苯二胺溶液，2.0 mL 十六烷基三甲基溴化銨溶液, 加塞，振搖1～2 min，在室溫下，于暗處放置35 min，測量熒光強度F(激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長433 nm)。最終的熒光強度為計算ΔF=F-F0。

1.4.2 樣品的測試

(1) 測試條件的確定。 實驗中選用乙酸鈉溶液為pH緩沖體系與氧化劑、CTAB為增敏劑、鄰苯二胺為輔助劑進行實驗，并采用模擬科研最佳條件的確定—正交實驗的方法確定各種物質(zhì)的最佳用量：以乙酸鈉溶液的濃度(A)、CTAB用量(B)、鄰苯二胺用量(C)以及反應溫度為考察因素(見表1)，以產(chǎn)物的熒光強度為考察指標，即采用4 個因素3 個水平的正交實驗表L9(34)(見表2)進行實驗。實驗前及實驗過程中對問題進行討論，實驗后將結(jié)果匯總，進行正交分析，以確定各種物質(zhì)的最佳用量[12-15]。

表1 正交實驗因素水平

[注]:A為乙酸鈉溶液的濃度(g/L), B CTAB用量(mL), C為鄰苯二胺用量(mL), D為反應溫度(℃)

表2 正交實驗的結(jié)果與分析

Ki(i= 1,2,3) 為：水平i三次考察指標(產(chǎn)物熒光強度) 之和的平均值；S為極差：由同一影響因素的K/3(K1/3、K2/3 、K3/3)中的最大值減去最小值。由極差分析可知， A 、B、C、D 四因素對產(chǎn)率影響順序，若為C > D > B > A，則表明鄰苯二胺用量的改變對產(chǎn)物的熒光的影響作用最大。同時，依據(jù)表中數(shù)據(jù)，產(chǎn)物的熒光強度最強的條件，即為四種物質(zhì)的最佳用量。

(2) 工作曲線、線性范圍、檢出限。分別移取0.5、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0 mL 按1)維生素C標準溶液的測試方法中得到的0.002 mg/mL 抗壞血酸/乙酸鈉溶液，置于10 mL 帶刻度的試管中，并稀釋至3.0 mL得到系列維生素C標準工作溶液，在最佳實驗條件下，按實驗方法進行測定，以熒光強度F對維生素C的濃度c(μg/mL)進行線性回歸，確定維生素C在什么濃度范圍內(nèi)(例如濃度在0. 02～8.0 μg/mL范圍內(nèi))，與熒光強度呈良好的線性關系，采用Origin軟件求出其線性回歸方程以及相關系數(shù)。條件容許還可繼續(xù)測定其檢出限，以確定其靈敏度。

(3) 精密度試驗。對5.0×10-4g/mL的維生素C標準工作溶液測定7次，求出其相對標準偏差，確定其精密度。

(4) 樣品測定。稱取均勻樣品10 g，用偏磷酸-冰醋酸溶液定容至100 mL，定容后過濾；將全部濾液轉(zhuǎn)入燒杯中加入1～2 g活性炭振搖1～2 min，過濾。取2只50 mL容量瓶，各加入5.0 mL經(jīng)氧化處理的樣液，并依據(jù)正交設計的實驗結(jié)果添加一定量的CTAB溶液，再向其中一只加入20 mL 乙酸鈉溶液，用水稀釋至50 mL作為樣品溶液；另一只加入20 mL硼酸-乙酸鈉溶液，用水稀釋至刻度，作為樣品空白溶液。再取2支帶塞的刻度試管，1支試管中加2.0 mL樣品溶液為樣液，另一根試管中加入2.0 mL樣品空白溶液作為空白，再分別用蒸餾水定容至3.0 mL。在室溫下，在避光的環(huán)境中，迅速向各管中加入5 mL鄰苯二胺溶液，加塞，振搖1～2 min，于暗處放置35 min。最佳發(fā)射波長條件下，測量熒光強度F，同時測定樣品空白溶液熒光強度F0，并計算得出實際熒光強度ΔF=F-F0。

最后，依據(jù)維生素C的標準曲線，確定果珍中維生素C含量。

1.5 分析過程中的注意點

(1) 標準抗壞血酸溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配。

(2) 活性炭處理樣品前，一定要先進行活化處理。

(3) 熒光測試過程中，多次測定，取平均值。

(4) 在處理各種樣品時, 如遇到泡沫產(chǎn)生, 可以加入數(shù)滴辛醇消除。

1.6 實驗教學效果評價

在教學實驗過程中，我們以新世紀創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)為目標，依據(jù)《普通高等學校本科教學工作水平評估方案》的導向要求，在傳統(tǒng)的評價體系的基礎上，引入多元智能理論，奉行多元化、情境化、發(fā)展性以及量化評價和質(zhì)性評價相結(jié)合原則，采用口試、過程檢測與檔案袋評價相結(jié)合的方式對學生的各種實驗技能、實驗思維等作比較全面的評價。在近兩年的實驗教學過程中，實驗效果評價的結(jié)果是20%左右優(yōu)秀，15% 的操作不理想，其余為中等水平; 學生普遍反映該實驗設計有助于理解熒光法的實驗原理，定性定量方法，以及正交實驗的系統(tǒng)設計與分析條件的優(yōu)化。

2 結(jié) 語

實驗時，每人測定1 份果珍樣品，使每位學生獨立地完成樣品前處理、定性、定量分析所要求的分析測試操作，且每份果珍樣品的質(zhì)量各不相同，防止有人“跟幫坐車”或抄襲實驗數(shù)據(jù)。對實驗成績的考核，重點放在對實驗的設計、實驗現(xiàn)象的解釋、對老師所提問題和思考題的回答以及動手操作上; 這些基本上能反應學生分析問題、解決問題和動手能力的強弱。通過該實驗既有利于啟迪學生的創(chuàng)新、設計思維，又有利于培養(yǎng)學生實踐、實際操作、創(chuàng)造、創(chuàng)業(yè)的能力以及強烈的責任心。

[1] 孫振艷，趙中一，郭小慧，等. 熒光分析法測定維生素C [J]. 化學分析計量，2006，15(4):18-20.

[2] 鄭京平. 水果、蔬菜中維生素C 含量的測定——紫外分光光度快速測定方法探討 [J]. 光譜實驗室，2006，23(4):731-735.

[3] 孫 劍，相開幕. 膠束增溶分光光度法測定還原型維生素C [J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009, 19(4): 818-819.

[4] 崔 香，寇雪玲. 熒光分析法測定枸杞中維生素C [J]. 青海師范大學學報(自然科學版)，2009(2): 58-60.

[5] 趙興紅, 郭新華. 抗壞血酸的快速比色測定[J]. 中國藥學雜志, 1991, 26(6): 358-360.

[6] 童裳倫. 熒光光度法測定維生素C [J]. 浙江大學學報(理學版), 2001, 28(5): 542-546.

[7] 李志英, 薛志偉, 張海容. 用熒光光度法測定飲料中的的Vc含量 [J]. 商丘師范學院學報, 2007, 23(9): 60-62.

[8] 鄭玉聰, 謝狄霖, 張維鎮(zhèn). 茶葉中維生素C 的熒光測定法[J]. 福建分析測試, 2005, 14(4): 2307-2308.

[9] 李秋菊,王亞紅,劉秀萍. 維生素C 的測定方法 [J]. 太原師范學院學報(自然科學版)，2005,4(1): 89-91.

[10] 章 麗，佘世科，高 峰，等. 一種新型環(huán)糊精衍生物的制備及熒光法測定抗壞血酸 [J].分析化學，2005，(11)：1583-1586.

[11] Li Xiaoyan, Zhang Yuanqin, Wang Lei, A new highly sensitive spectrofluorimetric method for the determination of ascorbic acid [J]. Journal of Sichuan University (Natural Science Edition), 2003, 40(3): 546-550.

[12] 周 蕊，余 蓉，楊繼虞. 固定化胰蛋白酶的快速制備 [J]. 生物技術，2004,14(3): 26-27.

[13] 許 謹，吳玉娟，黃 勛. 液膜處理含鉻廢液最佳條件初探 [J]. 貴州工業(yè)大學學報(自然科學版)，2004,33(6): 67-78.

[14] 鄧國棟，郁建平. 正交實驗優(yōu)選茶多糖提取工藝 [J]. 食品研究與開發(fā)，2004，25(4): 84-85.

[15] 陳 紅. 十六醇琥珀酸單酯磺酸鈉的合成及復配研究 [J]. 河北化工，2002(4): 37-40.

Experimental Design and Teaching of Determination of Vitamin C by Fluorescence Spectrophotometry

HUANGFang-zhi，SHENYu-hua,LIShi-kuo,XIEAn-jian

(School of Chemistry & Chemical Engineering, Anhui University， Hefei 230039， China)

A high-quality experimental chemistry course (Determination of vitamin C by fluorescence spectrophotometry) was designed and renewed through the reform practice of experimental teaching. In the experimental teaching, it was proved to be of value in training students' comprehensive and practical ability and in enlightening students' creative thoughts in their research activities. During the experiment process, students not only learn the method of orthogonal design and sample preparation, but also better understand and master the analysis principles, operation methods, qualitative and quantitative methods, and importance of fluorescence spectrophotometry in the analysis of natural compounds. A couple of years' running demonstrates that the high-quality experimental chemistry course is effective.

fluorescence spectrophotometry; chemical comprehensive experiment; experimental teaching; creative thinking

2014-09-15

國家自然科學基金(50973001);安徽大學教育教學改革研究項目(JYXM201331)；安徽大學精品實驗項目(SY201202)

黃方志(1978-)，男，安徽懷寧人，副教授，碩士生導師，基礎化學實驗中心副主任，研究方向:功能材料的制備與應用研究。

Tel.:0551-63861327; E-mail:huangfangzhi@163.com

G 642.423

A

1006-7167(2015)05-0097-03