一種基于感光干膜-銦錫氧化物電極的簡易細胞阻抗傳感器實現細胞形態學和阻抗信息同時檢測*

李 遠,胡 帆,廖 娟,胡禮儀,劉北忠

重慶醫科大學附屬永川醫院中心實驗室

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一種基于感光干膜-銦錫氧化物電極的簡易細胞阻抗傳感器實現細胞形態學和阻抗信息同時檢測*

李 遠,胡 帆,廖 娟,胡禮儀,劉北忠*

重慶醫科大學附屬永川醫院中心實驗室

加工一種基于感光干膜-銦錫氧化物DFP-ITO(Dry Film Photoresist-Indium Tin Oxide)電極的細胞阻抗生物傳感器并實現細胞形態學和阻抗信息同時檢測。35 μm厚的感光干膜層壓在ITO導電玻璃表面上作為絕緣層,通過照相制版技術在感光干膜絕緣層上蝕刻不同直徑圓孔;以DFP-ITO作為工作電極,通過夾具和測量小池與Ag/AgCl參比電極、Pt絲對電極相連構成三電極阻抗測量系統;考察了不同直徑DFP-ITO工作電極阻抗譜特征;通過細胞粘附實驗及細胞毒性實驗考察了感光干膜細胞生物相容性;通過光學顯微鏡和阻抗譜技術分別對接種在DFP-ITO電極上人肺癌細胞株A549粘附、增殖過程中的形態學和阻抗信息進行檢測和分析。研究結果發現不同直徑DFP-ITO電極具有相似的阻抗特性;充分固化的感光干膜表面適宜A549細胞粘附且無明顯的細胞毒性;基于DFP-ITO電極構建的細胞阻抗傳感器能夠通過光學顯微鏡獲取A549細胞形態學數據,同時通過阻抗譜技術能夠解析A549細胞粘附、增殖過程中的細胞質膜電容、細胞-細胞間隙電阻、細胞-ITO電極間隙電阻變化。本文發展了基于DEP-ITO電極的細胞阻抗傳感器結構簡單,可實現細胞形態學和阻抗信息的雙通道獲取,未來可用于細胞生理病理學行為和藥物細胞毒性研究。

生物傳感器;電化學阻抗檢測;感光干膜;銦錫氧化物;阻抗;細胞形態學

細胞阻抗傳感器作為一種具有連續性、無侵襲性特點的體外細胞分析技術能夠對細胞粘附、增殖、凋亡等生物學行為進行檢測[1-3],在藥物篩選[4]、毒物測試[5]、細胞生理參數分析[6]等領域中得到廣泛研究及應用。細胞阻抗傳感器技術最先由Giaever和Keese等報道[7],該技術構建的細胞阻抗生物傳感器由一對金材質的雙電極系統構建,包括一個面積為250μm直徑的工作電極和一個大面積的對電極。當細胞在電極表面發生形態學改變時,細胞作為具有頻率依賴性的電學元件,它的存在導致系統的阻抗譜發生改變,通過對系統阻抗譜進行解析來獲取細胞對應的生物學行為,該技術被稱為電子細胞-基底阻抗傳感技術ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing)。盡管基于ECIS技術的細胞阻抗傳感器具有測量細胞-細胞粘附、細胞-基質粘附、細胞膜性質等功能而被廣泛報道[8-9],然而以貴金屬金作為電極材料,不但成本高,而且透光性差,限制了基于光學手段的細胞形態學觀察。

銦錫氧化物(ITO)是一種具有良好透光性、生物相容性的導電材料,因此可作為一種電極材料構建各種細胞生物傳感器[10-12]。ITO導電膜通過平面磁控技術濺射在玻璃表面,具有表面電阻均勻、良好透光率和熱穩定性,市場上可獲得不同導電率的商品化ITO導電玻璃。ITO能夠在中性電解質溶液中保持電勢穩定性,因此可作為電極材料檢測培養環境中的細胞的電學特性,同時ITO電極材料良好的透光性能與光學顯微鏡集成,通過數字圖像技術獲取ITO電極上細胞的形態學信息[13]。此外,Gross等[14]將聚硅氧烷樹脂涂覆的ITO微電極用于記錄神經元細胞峰電位;CHoi C K等[11]通過光刻技術和反應離子蝕刻技術加工了光學透明的ITO氮化硅電極作為內皮細胞阻抗生物傳感器。研究發現ITO電極材料比金電極具有更優的透光性,能夠檢測細胞松弛素D對豬肺動脈內皮細胞的響應行為。盡管上述研究報道了ITO電極材料在細胞阻抗生物傳感器的應用價值,但ITO電極加工需依賴昂貴的濺射和光刻設備,且工藝復雜,限制了ITO電極在細胞阻抗生物傳感器的制備及推廣。

感光干膜作為一種光聚合物材料主要應用于印刷電路板工藝。相對于液體光刻膠,感光干膜具有諸多優勢,如良好的適應性,基材粘附性、平整性、感光材料均勻分布性、低曝光功耗及低成本[15]。更為重要的是,感光干膜光刻不需要超潔凈空間和昂貴的光刻設備,作為液態光刻膠的替代物還可應用在微流體通道加工[16]、電鑄模具[17]等。

本文提出了一種基于感光干膜的ITO電極加工工藝,并將制備的感光干膜-ITO(DFP-ITO)電極作為細胞阻抗傳感器以實現細胞形態學和阻抗信息的雙通道獲取。為此,首先表征了不同直徑的DFP-ITO電極阻抗特征,其次通過細胞粘附實驗及細胞毒性實驗對感光干膜細胞生物相容性進行評價;在此基礎上,通過光學顯微鏡和電化學阻抗譜技術分別獲取了DFP-ITO電極表面上人肺癌細胞株A549粘附和增殖過程中細胞形態學和阻抗信息。

1 方法和材料

1.1 感光干膜ITO電極加工

ITO導電玻璃購于珠海凱為光電科技有限公司(中國),ITO導電膜厚(220±30)nm,面電阻≤7 Ω/m2,玻璃基底厚度為1.1 mm。ITO導電玻璃分別用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗15 min,烘干待用。感光干膜型號為HQ-6100,購于長興化學工業股份有限公司,感光層厚度為35 μm,是一種低成本負性光刻膠。DFP-ITO電極加工流程示意如圖1所示:①感光干膜通過辦公覆膜機(100 ℃)壓貼在導電玻璃ITO膜表面,目測感光干膜與ITO膜緊密貼附且兩者間無氣泡;②矢量圖繪制軟件Coreldraw 12.0(Corel公司,Canada)繪制出ITO電極和引線接口圖案,通過噴墨打印機打印(ESPON 1390,Japan)以2 880 dpi分辨率打印在透明膠片上制成光掩膜,透過光掩膜對感光干膜進行紫外照射30 s;③將照射后的感光干膜在30 ℃下用1%的碳酸鈉顯影5 min,使未經紫外照射的ITO區域暴露,獲得DFP-ITO電極。隨后將電極用去離子水沖洗2次,60 ℃烘干,紫外照射60 s使感光膠完全固化。

圖1 DFP-ITO電極加工流程示意圖

1.2 A549細胞培養

人肺癌上皮細胞A549由重慶醫科大學附屬永川醫院中心實驗室常規培養。細胞用含10%胎牛血清(杭州四季青)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液(Gibco)中在37 ℃,5%二氧化碳條件下進行培養。待細胞生長至對數生長期,0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化細胞,1 500 rad/min離心4 min,按1∶3進行傳代。本文使用的A549細胞傳代次數為4至10代,使用時將A549細胞用DMEM細胞培養液制成不同濃度的細胞懸液。

1.3 感光干膜細胞相容性檢測

感光干膜的細胞生物相容性采用細胞粘附實驗和細胞毒性實驗進行驗證。細胞粘附實驗流程:將感光干膜剪切為面積為8 mm×8 mm方片,按上述DFP-ITO電極加工流程對感光干膜進行紫外照射、顯影處理后,放置于96孔板內,70%(v/v)濃度乙醇消毒。將100 μL A549細胞以濃度為2.5×105cells/mL接種在感光干膜表面,37 ℃、5%濃度二氧化碳條件下培養24 h使細胞貼壁,用濃度為10 μmol/L羅丹明123(Sigma)的PBS溶液對細胞線粒體進行熒光染色,倒置熒光顯微鏡(IX-71,奧林巴斯)觀察感光干膜表面上貼壁的細胞形態學和細胞熒光圖像;細胞毒性實驗流程:將100 μL A549細胞以濃度為5×104cells/mL密度接種在96孔板中,細胞培養箱中孵育2 h使細胞貼壁。隨后將感光干膜浸沒于細胞培養液中作為實驗組,同時以不含感光干膜的細胞孔為陰性對照組,只含感光干膜不含細胞的孔為空白組,每組設5個復孔,分別培養24、48和72 h后,將感光干膜從孔中取出,并在每孔中加入10 μL Cell Counting Kit-8(CCK-8)分析液(碧云天生物技術公司),輕搖混勻,37%、5%二氧化碳細胞培養箱中孵育2 h,多功能酶標儀(Varioskan,Thermo Scientific)測定溶液在450 nm的吸光度。感光干膜細胞毒性定義為:細胞毒性(%)=1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.4 DFP-ITO電極上細胞形態學和電化學阻抗譜檢測

為便于細胞培養及電化學阻抗譜測量,將DFP-ITO電極和測量小池通過聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)夾具固定,使DFP-ITO電極置于測量小池底部,測量小池體積為500 μL。DFP-ITO電極測量小池組裝示意圖和實物圖如圖2所示。

圖2 DFP-ITO電極細胞培養及電化學阻抗譜測量小池,測量小池含4個獨立測量單元

在細胞加載到DFP-ITO電極前,用70%乙醇對測量小池消毒5 min,隨后用滅菌去離子水清洗測量小池2次;將200 μL A549細胞懸液以濃度2.5×105cells/mL加載到含DFP-ITO電極的測量小池內,放置在超凈臺內室溫條件下靜止30 min后使細胞均勻沉降到電極表面,隨后放入37 ℃,5%二氧化碳細胞培養箱中進行培養,分別在2 h、24 h、48 h后將DFP-ITO電極取出放置到倒置熒光顯微鏡載物臺上進行細胞形態學觀察和圖像獲取。

DFP-ITO電極上A549細胞阻抗信息通過電化學阻抗譜EIS(Electrochemical Impedance Spectroscopy)技術進行測量。電化學阻抗譜測量采用了CS315電化學工作站(武漢科斯特儀器有限公司),電化學阻抗譜測量系統采用三電極系統,以接種了細胞的DFP-ITO電極作為工作電極,將Ag/AgCl絲參比電極(直徑:0.5 mm,長度:10 mm)和鉑絲對電極(直徑:1.0 mm,長度:10 mm)插入測量小池內進行電化學阻抗譜測量。測量以0.01 mol/L PBS作為支持電解質溶液,以幅值為10 mV正弦波為激勵信號,掃描頻率范圍為1 Hz～105Hz,阻抗譜測量數據用ZView 2.0軟件進行分析。

2 結果及討論

2.1 DFP-ITO電極的加工及阻抗表征

在細胞阻抗傳感器研究中,金電極具有優良的導電性、生物相容性而被廣泛用于檢測細胞粘附、增殖、腫瘤細胞間質轉化、細胞對藥物響應等信息[1-4,6]。其基本策略是將測量得到的阻抗數據譜數據與理論等效電路擬合來間接獲取細胞信息,具有無侵入性、連續性檢測的優點[18]。然而,金材料電極透光性差,限制了金材料電極上細胞形態學的觀察[10-13]。而事實上,細胞的形態學數據是一類重要的細胞生物學行為信息,通過形態學數據能夠獲取細胞的增殖、凋亡、亞細胞微觀結構、細胞蛋白表達等信息[19]。相比阻抗學數據,形態學數據更為直觀、更易理解。因此,構建一種能夠同時獲取細胞的阻抗信息和形態學的細胞阻抗生物傳感器將有助于提高生物傳感器的準確性和多功能性。

ITO電極由于具有良好的導電性和透光性,因此具有作為電極材料具有實現細胞阻抗譜信息和形態學信息同時檢測的潛力而被研究報道[10-13]。為實現細胞阻抗譜信息采集,需要加工ITO工作電極。加工ITO電極主要采用兩類方法:一類是top-down途徑,即在ITO板上通過化學刻蝕加工出ITO電極[11];另一類是bottom-up途徑(approach),即在圖形化的基底上通過濺射方式加工出ITO電極[12]。然而,蝕刻和濺射形成的ITO電極接觸電阻較大,導致細胞阻抗傳感器靈敏度降低;另外,蝕刻和濺射途徑加工ITO電極采用液態光刻膠作為電極圖像犧牲層,以光刻技術為基礎,加工工藝、成本較高。表1為文獻報道的采用ITO微電極構建細胞阻抗生物傳感器涉及到的加工工藝及參數比較,可見本研究發展的以感光干膜作為絕緣層,以商品化ITO導電玻璃為基底,通過對感光干膜進行選擇性紫外照射、顯影獲得ITO電極的方法不需要對ITO進行刻蝕,降低了工藝復雜性和ITO電極的接觸電阻,且能夠獲得最小直徑為100μm的ITO電極。

表1 ITO電極構建細胞阻抗生物傳感器比較

圖3 不同直徑DFP-ITO電極圖片和阻抗譜特征

構建細胞阻抗生物傳感器需要考慮一系列重要參數,其中工作電極面積是影響細胞阻抗傳感器靈敏度重要參數之一[20]。本研究首先加工了0.5 mm、1.0 mm、1.5 mm和2 mm 4種不同直徑的DFP-ITO電極,結果如圖3(a)所示。實驗發現,0.5 mm直徑感光干膜ITO電極與參比電極間在支持電解質溶液中出現過高的開路電位(open circuit potential),提示0.5mm直徑的DFP-ITO電極與電解質溶液接觸阻抗大,推測其原因與感光干膜厚度和疏水性質有關。圖3(b)為直徑分別為1.0 mm、1.5 mm、2.0 mm的DFP-ITO電極阻抗譜,顯示不同直徑電極間的阻抗具有相似的頻率依賴特性,其整個頻率范圍內電極阻抗值與直徑成反向關系,其原因在于ITO電極與電解質溶解界面形成的電荷雙分子層有關。該結果與文獻報道的金電極結果相似[20-21]。當細胞在ITO電極表面粘附與鋪展時,由于面積小的ITO電極對細胞形態學變化表現出更高的靈敏性[20]。因此后續細胞阻抗測量實驗選擇直徑為1.0 mm ITO電極。

2.2 感光干膜細胞生物相容性評價

感光干膜是一種基于丙烯酸酯的光聚合物,除應用于PCB工藝中,在其他細胞生物學研究領域中也有報道,如微流控芯片[15]。然而,感光干膜的細胞生物相容性卻未見報道。本研究從細胞粘附和細胞毒性考察了感光干膜細胞生物相容性,實驗結果如圖4所示。

圖4(a)為A549細胞接種在感光干膜24 h細胞發生粘附的明場和熒光顯微圖片,結果顯示細胞能在感光干膜粘附并鋪展,羅丹明123對細胞線粒體熒光染色顯示粘附在感光干膜表面A549細胞具有良好的生物活性,該結果說明感光干膜可為A549細胞提供適宜的生長界面。

圖4(b)為兩種不同處理的感光干膜的細胞毒性結果。實驗發現,未經過后曝光步驟的感光干膜細胞毒性顯著高于經過后曝光處理的感光干膜,且隨孵育時間延長,細胞毒性效率更為明顯,孵育72h兩種感光干膜的細胞毒性間比值約為4.86。該結果說明感光干膜的后曝光是影響其細胞毒性的關鍵因素,原因在于后曝光步驟能夠使感光分子完全聚合,避免未聚合的光敏分子在細胞培養時釋放進細胞培養液對細胞產生細胞毒性。同時,實驗還發現未經過后曝光處理的感光干膜在培養液中浸泡24 h后開始出現軟化、表面開始皺褶,而后曝光處理的感光干膜形態未發生改變(數據未給出)。事實上,后曝光處理的感光干膜仍具有輕微的細胞毒性(72 h為12.6%),推測原因為感光干膜吸附了培養液中蛋白分子對細胞生長造成輕微抑制。因此,細胞接種前用空白培養液對感光干膜進行預孵育降低其對細胞生長抑制效應。

圖4 感光干膜的細胞生物相容性

2.3 DFP-ITO電極上A549細胞粘附增殖行為的形態學和阻抗譜檢測

ITO作為電極材料構建細胞阻抗生物傳感器最具吸引力的特點在于可實現細胞形態學和阻抗信息的雙通道檢測。為對該技術進行原理驗證,本文構建了基于DFP-ITO電極的細胞阻抗傳感器,并檢測了A549細胞的粘附、增殖過程中細胞形態學和阻抗信息。圖5為A549細胞接種在ITO電極上2 h、24 h和48 h時的形態學顯微圖片,顯示A549細胞在ITO電極上均勻鋪展,通過顯微鏡能夠觀察到細胞的鋪展(2 h)、增殖(24 h)及細胞單層形成(48 h)。該結構說明ITO作為電極材料適宜細胞粘附與增殖,其良好的透光性便于獲取細胞形態學數據。

當A549細胞在DFP-ITO電極表面粘附和增殖時,細胞作為具有頻率依賴性的電學原件導致系統阻抗譜發生改變,因此可通過阻抗譜技術對DFP-ITO電極上細胞的粘附、增殖行為進行檢測和解析。

圖5 利用光學顯微鏡觀察DFP-ITO電極表面的A549細胞分別在2 h、24 h和48 h時的形態學信息

圖6 DFP-ITO電極上細胞粘附增殖行為電化學阻抗譜檢測

圖6(a)為A549細胞接種在DFP-ITO電極上0、2 h、24 h和48 h對應的電化學阻抗譜復平面圖,可見A549細胞在ITO電極上的增殖導致系統阻抗譜高頻部分發生改變。在復平面圖擴展標度(expanded scales)中更清楚顯示A549細胞增殖導致系統阻抗譜的高頻部分形成半圓,且隨著細胞增殖高頻部分半圓直徑增大。該結果說明電極界面上細胞增殖導致電極界面上離子電荷轉移過程速度減慢,其原因與細胞質膜電容特征有關[22]。另外,在低頻區域,A549細胞的增殖未對系統阻抗譜產生明顯變化,其原因在于細胞在低頻部分其電學特性為典型絕緣體,電極與電解質溶液的離子電流主要通過細胞間隙進行轉移而未穿過細胞,因此阻抗譜的低頻區域不能夠反映出細胞行為學變化。

為進一步分析DFP-ITO電極上不同階段A549細胞的容抗特性,本研究采用了文獻[18]報道的細胞等效電路模型,如圖6(b)所示。細胞等效電路由一個RC并聯電路和一個R元件串聯組成,其中,R′s理論上解釋為細胞-電極的間隙電阻,Rcell解釋為細胞-細胞電阻,Ccell解釋為細胞質膜的電容效應。通過曲線擬合技術將系統阻抗譜半圓部分與細胞等效電路模型進行擬合,A549細胞不同生長階段等效電路元件值如圖6(c)所示。從結果可知,隨著A549細胞在ITO電極界面的粘附和增殖,Ccell值緩慢增加,而Rcell值和R′s值逐漸增加。形成細胞單層后Ccell值約為2.8 nF,Rcell值約為754 Ω,約為216 Ω。同時,當A549細胞從貼壁后(2 h)至形成細胞單層(48 h)間,Rcell值持續增加說明細胞-細胞間的間隙逐漸縮小,細胞融合度增加;R′s值持續增加則提示細胞-ITO電極間距離縮小,細胞粘附強度增強。相反,Ccell值對A549細胞的增殖至形成細胞單層的形態學變化不敏感。此外,仔細分析數據還發現從細胞接種(0 h)至細胞貼壁(2 h)間的各元件值改變較小,說明本系統對于該過程的細胞生物學行為檢測靈敏度不足,其原因在于本系統使用ITO電極面積(0.785 mm2)較大,A549細胞在ITO電極表面粘附不足以改變系統的阻抗譜。因此,在不影響電極透光性的前提下通過電極修飾提高檢測細胞阻抗傳感器檢測靈敏度還正在研究中。

綜上結果分析可知,以DFP-ITO電極為基礎構建的細胞阻抗傳感器能夠耦合光學顯微成像技術和電化學阻抗譜技術,實現細胞形態學和阻抗信息的同時檢測。在同一電極上獲取的細胞形態學數據和阻抗信息互為補充、驗證,提高細胞信息檢測的全面性和準確性。

3 結論

本文發展了一種結構簡單、易于加工的DFP-ITO電極細胞阻抗傳感器,通過對A549細胞粘附、增殖的形態學和阻抗信息的測量對構建細胞阻抗傳感系統進行原理性驗證。研究采用感光干膜作為絕緣層降低ITO電極加工難度、成本和時間,且感光干膜表面適宜A549細胞粘附,對A549細胞生長且無明顯細胞毒副作用;細胞阻抗傳感器以ITO作為電極,通過光學顯微鏡可電極上A549細胞的形態學信息;利用電化學阻抗譜技術和細胞等效電路擬合能夠檢測DFP-ITO電極上A549細胞的粘附和增殖過程中阻抗信息;本文發展的DFP-ITO電極細胞阻抗傳感器結構簡單、易于加工,能夠同時獲取細胞形態學和阻抗特征值,可在普通實驗室推廣并用于細胞生理病理行為、藥物篩選等研究領域。

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李 遠(1985-),男,重慶醫科大學,博士研究生,主要研究方向為微流控芯片及細胞生物傳感器,liyuan_1985999@163.com;

劉北忠(1970-),男,重慶醫科大學,教授,主要研究方向為生物醫學微納米技術與系統、腫瘤分子診療靶點篩選等,lbzemail@163.com。

A Simple Cellular Impedance Biosensor Based on Dry FilmPhotoresist-Indium Tin Oxide Electrode for Detecting CellularMorphology and Impedance Information Simultaneously*

LIYuan,HUFan,LIAOJuan,HULiyi,LIUBeizhong*

(Central Laboratory of Yongchuan Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 402160,China)

This study describes the fabrication of a simple cellular impedance biosensor based on dry film Photoresist-indium tin oxide(DFP-ITO)electrode for detecting the cellular morphology and impedance information simultaneously. A dry film photoresist layer of 35 microns thickness was laminated on the surface of the ITO conductive glass as an insulating layer,and then circular holes with different diameters were etched on the insulation layer by photolithography technique. The exposed ITO electrode,as a working electrode,was connected to an Ag/AgCl reference electrode and a Pt counter electrode through a clamp and a measuring pool to constitute a Three-electrode impedance measurement system. The impedance of the DFP-ITO electrodes was investigated by impedance spectroscopy technology. The biocompatibility of the dry film photoresist was investigated by experiments of cell adhesion and cell toxicity. The biological behavior information about cell adhesion and proliferation of the A549 lung cancer on the DFP-ITO electrode was analyzed by optical microscope and impedance spectroscopy technology respectively. Results showed that the DFP-ITO electrodes with different diameters had similar impedance characteristics. Fully cured dry film photoresist could provide an appropriate surface for A549 cell adhesion and had no obvious cytotoxicity. The cellular impedance sensor based on the DFP-ITO electrode could be used to obtain the morphological data and analyze the changes of the cytoplasm membrane capacitance,cell-cell gap resistance and cell-ITO electrode gap resistance during the process of adhesion and proliferation of A549 cell by optical microscope and impedance spectrum technology respectively. The cellular impedance biosensor based on DFP-ITO electrode has a simple structure and can realize the Dual-channel acquisition of cell morphology and impedance information. It can be used in the fields of cellular physiological and pathological behavior and drug cytotoxicity in the future.

biosensor;electrochemical impedance detection;dry film photoresist;indium tin oxide;impedance;cell morphology

項目來源:重慶市自然科學基金面上項目(cstc2012jjA10046);重慶市永川區創新能力建設平臺項目(Ycstc,2014bf5001);重慶市級大學生創新創業訓練計劃項目(201410631012);重慶醫科大學大學生科研與創新實驗項目(201413)

2014-12-19 修改日期:2015-03-01

C:7230J

10.3969/j.issn.1004-1699.2015.06.001

TP212.3

A

1004-1699(2015)06-0779-08