TNF-α在CCD模型大鼠背根神經節中的表達及機制*

張淑芬， 楊紅軍， 鄧兵梅， 武肖娜

(1廣州軍區廣州總醫院神經內科，廣東 廣州 510010； 2廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510504)

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TNF-α在CCD模型大鼠背根神經節中的表達及機制*

張淑芬1, 2， 楊紅軍1△， 鄧兵梅1， 武肖娜1

(1廣州軍區廣州總醫院神經內科，廣東 廣州 510010；2廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510504)

目的： 探討TNF-α和NF-κB在背根神經節慢性壓迫(CCD)模型大鼠背根神經節(DRG)中的表達變化及其對疼痛學行為的影響。方法: 建立CCD大鼠模型，采用von Frey纖維絲監測機械痛閾的改變；通過Western blotting檢測TNF-α和NF-κB在DRG中的表達變化趨勢，分析其與疼痛行為之間的相關性；并采用免疫熒光雙染技術研究TNF-α在DRG中的表達位置。結果: CCD組的50%機械縮足閾值在術后1 d即開始明顯下降(P<0.01)，7～14 d達到高峰，其后逐漸上升，直至術后35 d仍明顯低于術前及sham組(P<0.01)。而DRG上的TNF-α及NF-κB于造模后各時點均顯著增多(P<0.01)，且TNF-α的表達趨勢與50%機械縮足閾值顯著相關(P<0.05)。結論: DRG慢性壓迫可促進其上的TNF-α和NF-κB的合成和分泌，進而誘發機械痛覺過敏。因此，TNF-α/NF-κB信號通路可能是CCD模型疼痛形成的重要通路之一。

背根神經節慢性壓迫模型； 背根神經節； 腫瘤壞死因子α； 核因子κB

神經病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是由軀體感覺神經系統的損傷或疾病所直接引起的疼痛[1]。其發病機制復雜，目前尚無統一定論。近年來，隨著對NP研究的深入，發現許多免疫細胞和炎性細胞因子在其形成和維持中發揮著重要作用，其中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)最為關鍵。大量研究證實TNF-α在各種不同神經痛模型的不同組織如周圍神經、背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)、脊髓、腦中均有一定程度升高[2-6]，但其機制不明。

TNF-α作為一種重要的前炎癥介質，其可通過與細胞表面受體結合，激活IKK，引起IκBα磷酸化降解，使核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活化，而活化的NF-κB轉移入細胞核，調控靶基因的表達。因此，本研究假設TNF-α/NF-κB信號通路為NP形成的重要通路之一，通過建立背根神經節慢性壓迫(chronically compressed dorsal root ganglion，CCD)模型，研究TNF-α及NF-κB在此模型DRG中的表達規律，并探討TNF-α與疼痛行為學之間的關系。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

清潔級成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只，由廣東省實驗動物中心提供，體重200～250 g。實驗于廣州軍區廣州總醫院動物實驗中心進行，術前飼養5 d以適應環境。隨機取10只作為假手術(sham)組，剩下的25只為CCD組。2組各取5只，分別于手術前2 d、1 d以及手術后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d進行行為學測定。同時，CCD組分別于術后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d取材，而sham組均于術后7 d取材。取得的DRG分別用于進行Western blotting和免疫熒光實驗。

2 實驗方法

2.1 模型建立方法 CCD模型的制備方法已有文獻報導[7]。將動物麻醉后，剪毛并消毒背部皮膚，俯臥位，于背部正中L4～5水平作一縱行切口，分離棘突左側皮下組織及肌肉，暴露左側第4、5腰椎(L4、L5)的椎間孔，將兩根L型不銹鋼柱(長4 mm,直徑0.5～0.8 mm)插入L4、L5椎間孔以形成對DRG的持續壓迫，此時可見左下肢肌肉輕微抽動，逐層縫合肌肉、皮膚。而sham組僅暴露L4、L5椎間孔，不插入L型鋼柱。

2.2 機械刺激撤足閾值的測定方法 50%機械刺激撤足閾值的測定采用Chaplan等[8]的Up-Down法：將大鼠置于透明有機玻璃箱中，底為0.5 cm×0.5 cm孔徑的鐵絲網。測試前3 d，讓大鼠每天在玻璃箱中適應30 min以上。測試時，待大鼠安靜后，選8根不同強度(0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g)的von Frey 纖維絲刺激大鼠左后肢足心部，每次持續時間3～5 s。以2.0 g為初始刺激強度，若撤足反應為陰性則選用刺激強度遞增的相鄰纖維絲繼續刺激，若撤足反應為陽性，則選擇相鄰遞減的強度給予刺激，如此類推，直至撤足反應為陽性后再連續刺激5次。記錄測試結果，相關軟件計算50%機械撤足閾值。

2.3 Western blotting實驗 大鼠麻醉后，切開背部皮膚，剪去棘突、肌肉及后椎板，取下左側L4、L5 DRG。稱其重量，每100 g組織加入100 μL 含1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的SDS裂解液，組織剪碎后用超聲破碎儀將其充分裂解，4 ℃ 12 000×g離心20 min，取上清。BCA試劑盒測出蛋白濃度。各組分別取相同總量進行電泳、轉膜；將膜置于1∶200稀釋的TNF-α抗體(Abcam)、1∶500稀釋的NF-κB抗體(Abcam)和1∶1 000稀釋的β-actin抗體(CST)中，4 ℃搖床上孵育過夜，次日室溫內復溫30 min；TBST洗10 min 3次；加入 II 抗，室溫搖床上孵育1 h；TBST洗10 min×3次；將膜置于凝膠拍攝系統的暗盒內，加入ECL發光液，通過調節不同曝光時間來將目的條帶顯示出來，并拍照。最后用相關分析軟件比較不同組別目的蛋白之間的差異。

2.4 免疫熒光雙染方法 大鼠麻醉后，用250 mL生理鹽水快速心臟灌注，再用4%多聚甲醛，速度先快后慢，至大鼠完全僵硬。切開背部皮膚，剪去棘突、肌肉及后椎板，取下左側的L4、L5 DRG。先于4%多聚甲醛中后固定30 min，再用30%蔗糖脫水2 d。明膠包埋后連續冰凍切片，片厚16 μm。切片用5% BSA封閉1 h；全部切片滴加1∶50稀釋的小鼠來源的TNF-α抗體，并在需要雙染的切片中分別滴加1∶100的GFAP抗體(衛星膠質細胞染色)、1∶50的NF-200抗體(大神經元染色)及1∶100的IB4抗體(小神經元染色)(Abcam)，4 ℃冰箱內孵育過夜，次日室溫復溫30 min；PBS洗10 min 3次；滴加結合Cy3抗小鼠 II 抗和FITC抗兔 II 抗，室溫避光孵育1 h；PBS避光洗10 min 3次。熒光顯微鏡拍照。

3 統計學處理

實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表達，采用SPSS 13.0軟件，利用t檢驗分析CCD組與sham組之間的疼痛行為學和TNF-α的表達是否有顯著差異，并用非線性回歸分析計算TNF-α與50%機械縮足閾值之間的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CCD模型大鼠的50%機械縮足閾值改變

CCD組大鼠損傷側的50%機械縮足閾值于術后1 d開始下降，與術前及sham組相比，均存在極顯著差異(P<0.01)。而于7～14 d時下降最明顯，其后開始逐漸回升，直至術后35 d，機械痛閾仍明顯低于術前和sham組(P<0.01)。同時，損傷對側的機械閾值于術后也持續低于術前和sham組(P<0.01)。而sham組沒有觀察到明顯的痛覺過敏現象, 各時點與術前相比無顯著差異，見表1。

2 TNF-α在CCD模型大鼠DRG上的表達情況

免疫熒光實驗結果證明，TNF-α在CCD模型大鼠DRG中的表達較sham組明顯增多。其在sham組的DRG無明顯著色，呈弱陽性表達(圖1A)，而造模7 d后TNF-α則呈強陽性表達，免疫物質呈紅色(圖1B)。免疫熒光雙染結果顯示TNF-α與GFAP、NF-200及IB4均存在共染(圖1C～E)，表明其主要在大、中、小DRG神經元及其周圍的衛星膠質細胞中表達。

Western blotting結果表明，TNF-α在sham組大鼠DRG中表達很弱，而CCD術后1 d開始增多，與sham組相比存在極顯著差異(P<0.01)。其表達于7～14 d達到高峰，隨后逐漸下降。直至實驗觀察結束(術后35 d)，其表達量與sham組之間仍有極顯著差異(P<0.01)，見圖1F。

表1 Sham組與CCD組于術前及術后各時點的50%機械痛閾

Table 1.The 50% paw withdrawal threshold of the rats in sham and CCD groups at different time points after CCD operation(g. Mean±SD,n=5)

Postoperativetime(d)ShamCCDIpsilateralContralateralIpsilateralContralateral-225.37±023.86±3.3823.86±3.3822.34±4.14-123.86±3.3822.34±4.1425.37±023.86±3.38118.76±7.3722.34±4.142.01±0.72**##6.27±3.44**##420.83±4.1420.83±4.141.37±1.32**##3.53±1.78**##722.34±4.1422.34±4.140.33±0.10**##2.16±0.75**##1020.83±4.1420.83±4.140.53±0.35**##2.26±0.80**##1422.34±4.1422.34±4.140.76±0.67**##2.04±0.81**##2123.86±3.3823.86±3.381.34±0.49**##3.45±2.31**##2825.37±025.37±02.92±1.50**##3.95±1.62**##3523.86±3.3823.86±3.383.05±1.65**##4.55±1.43**##

**P<0.01vspre-peration (postoperative -1 or -2 d);##P<0.01vssham.

Figure 1.The expression of TNF-α in the DRG of CCD group. A: the expression of TNF-α in sham group; B: the expression of TNF-α in CCD group; C～E: TNF-α expressed in all sizes of DRG neurons and the satellite glial cells; F: the expression of TNF-α in DRG at different time points after CCD detected by Western blotting. Mean±SD.n= 3.**P<0.01vssham.

圖1 TNF-α在CCD模型大鼠DRG中表達的位置及時間趨勢

3 DRG中TNF-α表達與50%機械縮足閾值之間的關系

CCD組大鼠DRG中TNF-α的表達與50%機械縮足閾值之間的非線性回歸方程為y=7.744e-2.748x(R2=0.643，n=6)，有顯著相關性。

4 p-NF-κB在CCD模型大鼠DRG上的表達趨勢

p-NF-κB在sham組大鼠DRG中表達較弱，CCD造模術后1 d開始增多，與sham組相比存在極顯著差異(P<0.01)；其表達于7 d達高峰，隨后逐漸下降，于術后28 d已恢復正常，與sham組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

Figure 2.The protein levels of p-NF-κB in the DRG of CCD group at different time points after CCD. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssham group.

圖2 CCD后不同時間p-NF-κB在大鼠DRG中的蛋白水平

討 論

慢性腰腿痛是一種常見的神經病理性疼痛，由于腰椎的退行性變或腰部外傷，致使椎間盤突出、脊椎韌帶鈣化或骨質增生，從而造成椎管和椎間孔狹窄，進而對DRG及其鄰近神經根形成慢性壓迫，導致神經組織水腫、變性，引起腰及下肢疼痛，但具體機制不明。本研究通過使用不銹鋼柱壓迫DRG，進而模擬腰椎間盤突出或腰椎管狹窄引起的神經痛，從而探討其發病機制。

目前很多研究認為，在外周和中樞神經系統中，炎性細胞因子可能參與神經痛的形成，其中TNF-α是較為確定的細胞因子之一。在神經分支選擇性損傷、慢性壓迫損傷等周圍神經損傷模型中，均發現脊髓和背根神經節等部位的神經元及膠質細胞中TNF-α表達明顯上調[5, 9]。而坐骨神經周圍注入微量TNF-α也可引起明顯的痛覺過敏，其疼痛程度與劑量呈正相關[10]。上述研究均提示，TNF-α在神經病理性疼痛的形成中起著關鍵作用。本研究結果表明，DRG慢性壓迫可引起其上的TNF-α明顯升高，且其表達趨勢與機械痛閾的進展變化呈指數關系。因此，我們推斷，DRG上TNF-α的過表達是引起機械痛覺過敏的重要原因之一。另外，免疫雙染實驗結果顯示，增多的TNF-α主要表達在DRG神經元及其周圍的衛星膠質細胞上。這與既往的研究結果相似：周圍神經損傷后，各類膠質細胞增殖并被激活[11-12]，進而產生各種炎性因子；而DRG神經元則通過激活其上的Toll樣受體，繼而引起自身TNF-α和p-p38上調[9, 13]。

TNF-α作為前炎性細胞因子，不僅可通過上調受損DRG神經元的Na+離子通道[14](Nav1.1、Nav1.3和Nav1.8)，使自發放電增多，從而引起痛覺過敏[15]，還可通過MAPK、NF-κB等信號通路，促進自身及其它細胞因子的合成和分泌，導致炎癥介質的瀑布效應，以進一步參與神經痛的維持。我們的結果提示，TNF-α及NF-κB均于壓迫早期開始明顯增多，兩者表達峰值幾乎一致。然而，TNF-α于術后1 d的增加倍數較NF-κB大；且NF-κB于術后7 d開始下降，直至28 d已基本恢復至正常水平，而TNF-α在術后14 d才開始逐漸減少，直至35 d，其表達量仍維持在較高水平。由此證明，DRG被壓迫后TNF-α迅速增多，參與神經痛的發生；并通過啟動NF-κB信號通路促進自身的合成和分泌，以進一步維持神經病理性疼痛。

綜上所述，在CCD模型中，TNF-α/NF-κB信號通路是引起神經病理性疼痛的重要通路之一，其參與了機械痛覺過敏的發生與維持。

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中國病理生理學會第十屆全國代表大會暨學術會議第一輪通知

中國病理生理學會第九屆全國代表大會暨學術會議將于2015年11月6日至11月9日在天津賓館舉行。本次大會由中國病理生理學會主辦，天津醫科大學承辦。

大會主席由全國人民代表大會副委員長、中國科協主席、國際病理生理學會主席、中國病理生理學會理事長韓啟德院士擔任。在中國病理生理學會第九屆全國代表大會上，將審議中國病理生理學會第九屆理事會工作報告和章程修改報告，進行換屆選舉。

隨著基礎與臨床相關研究日益密切以及轉化醫學概念的深化，病理生理學科與臨床學科的相互交流和滲透的要求尤為迫切。因此，本次學術會議將對心血管、干細胞、腫瘤、免疫、炎癥及神經生物學等多個領域進行廣泛的研討，邀請眾多國內外著名學者和臨床工作者共聚一堂，從不同角度切磋共同關心的課題，以促進學科融合，繁榮學術交流，進而達到雙贏效果。同時，為了鼓勵與培養青年優秀科研工作者，會議期間還將進行青年優秀論文的評獎活動。

本次大會鼓勵參會代表積極向本次會議投稿，并擬對35歲以下(1980年10月30日以后出生)與會者的優秀論文予以獎勵。由大會評審委員會選出優勝者，頒發獎勵。大會只接受電子版摘要，請大家于2015年6月30日前登陸中國病理生理學會網站(http://www.caop.ac.cn/)進行在線投稿(在會議通知下方有網上提交系統，填寫相關信息后提交即可；請注明是否參加優秀青年論文評比)。

中國病理生理學會第十屆全國代表大會組織委員會

2015 年 3月 31日

Expression and function of TNF-α in dorsal root ganglion of rats with chronically compressed dorsal root ganglion

ZHANG Shu-fen1, 2, YANG Hong-jun1, DENG Bing-mei1, WU Xiao-na1

(1DepartmentofNeurology,GuangzhouMilitaryGeneralHospital,Guangzhou510010,China;2GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510504,China.E-mail:neuroyhj@163.com)

AIM: To investigate the role of TNF-α and NF-κB in the mechanism of neuropathic pain due to chronically compressed dorsal root ganglion (CCD). METHODS: Based on the CCD model, von Frey filaments were used to quantify behavior test. The expression changes of TNF-α and NF-κB were determined by Western blotting, and the correlation between the expression of TNF-α and the 50% paw withdrawal threshold was also analyzed. Moreover, the location of TNF-α in dorsal root ganglion (DRG) was observed with immunofluorescence double staining. RESULTS: We found 50% paw withdrawal threshold of CCD decreased at the first day after operation. The mechanical allodynia was the most obvious at postoperative 7～14 d and lasted longer than 35 d. The expression of TNF-α and NF-κB increased significantly in DRG after operation (P<0.01), especially at 7～14 d, and then restored gradually. Moreover, there was a correlation between the protein expression of TNF-α and the changes of neuropathic behavior (P<0.05). CONCLUSION: TNF-α and NF-κB are involved in the mechanism of mechanical allodynia after chronically compressed DRG.

Chronically compressed dorsal root ganglion; Dorsal root ganglion; Tumor necrosis factor-α; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2015)04- 0675- 05

2014- 11- 24

2015- 03- 04

廣東省自然科學基金資助項目(No. S2012010009849)；全軍醫學科技“十二五”科研面上項目(No. CWS11J272)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.018

△通訊作者 Tel: 020-88653321； E-mail: neuroyhj@163.com