咪唑克生對體外血腦屏障炎癥模型通透性的影響*

王新施， 朱 攀， 朱振國， 夏念格， 李 佳， 鄭榮遠

(溫州醫科大學附屬第一醫院神經內科，浙江 溫州 325000)

?

咪唑克生對體外血腦屏障炎癥模型通透性的影響*

王新施， 朱 攀， 朱振國， 夏念格， 李 佳， 鄭榮遠△

(溫州醫科大學附屬第一醫院神經內科，浙江 溫州 325000)

目的： 觀察咪唑克生(idazoxan，IDA)對體外血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)炎癥模型的通透性、緊密連接蛋白ZO-1表達和分布及基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)和MMP-9抑制物——金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1， TIMP-1)表達的影響。 方法: 采用培養7 d的小鼠腦微血管內皮細胞株 b.End3建立體外BBB模型，采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h誘導BBB炎癥模型，并對BBB炎癥模型分別采用IDA 50、100、200 μmol/L預處理6 h以觀察IDA對BBB炎癥模型的作用。通過檢測異硫氰酸熒光標記的葡聚糖通過率來確立模型的通透性，采用Western blot法檢測緊密連接蛋白ZO-1的表達，通過免疫熒光法觀察ZO-1的分布情況，并通過RT-PCR法檢測MMP-9/TIMP-1的表達。結果: 培養7 d的b.End3細胞匯合成穩定的單層連接，有較好的屏障功能，而采用TNF-α處理24 h后誘導的BBB炎癥模型的通透性明顯升高，緊密連接蛋白ZO-1在膜上的表達明顯減少、不連續，Western blot法顯示ZO-1蛋白表達水平明顯下降，MMP-9的表達明顯升高；而采用IDA 50、100、200 μmol/L預處理6 h能明顯降低其通透性，增加ZO-1蛋白的表達和改善ZO-1的分布異常，降低MMP-9的表達，其中200 μmol/L IDA作用最明顯，差異有統計學意義(P<0.01)。結論: IDA能夠直接作用于腦血管內皮細胞，降低TNF-α誘導的體外BBB炎癥模型MMP-9的表達，增加緊密連接蛋白ZO-1的表達、修復緊密連接ZO-1的異常分布，從而改善其異常增高的通透性。

咪唑克生； 血腦屏障； 緊密連接； ZO-1; 基質金屬蛋白酶-9； 組織型基質金屬蛋白酶抑制物-1

血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)功能失調是多發性硬化(multiple sclerosis, MS)及其動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的一個重要病理途徑。研究發現，在EAE發病時及MS臨床復發時都存在BBB功能失調，BBB通透性增加，導致外周炎癥細胞和炎癥因子向中樞遷移，是EAE發病的一個重要環節，BBB的通透性與EAE的嚴重程度呈正相關[1]。但EAE/MS中BBB破壞的機制仍不明確。研究發現EAE/MS中BBB破壞的機制可能與基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)活性增高或MMP-9抑制物——金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1， TIMP-1)的平衡失調及BBB緊密連接蛋白-1(zonula occludens proteins-1，ZO-1)的表達異常等有關[2-4]。我們在前期的研究工作中已發現咪唑啉2受體(imidazoline 2 receptor，I2R)的配體咪唑克生(idazoxan，IDA)能增加BBB緊密連接蛋白ZO-1的表達，降低MMP-9的表達，降低EAE炎癥時異常增高的BBB通透性，從而減輕小鼠EAE時的BBB破壞、抑制中樞炎癥反應并減緩小鼠EAE的病情[5-6]。但IDA對EAE的保護作用是否直接繼發于其對BBB的保護作用仍未知，IDA在體外對腦血管內皮細胞的直接作用目前國內外尚未見報道。故本課題擬采用小鼠腦微血管內皮細胞b.End3單層細胞培養建立體外BBB模型，并采用MS/EAE發病起關鍵作用的炎癥細胞因子TNF-α誘導BBB炎癥模型，以模擬EAE時的BBB破壞，觀察IDA干預對體外BBB炎癥模型的通透性、緊密連接蛋白ZO-1表達和分布及MMP-9/TIMP-1表達的影響來探討IDA對BBB的直接作用及相關的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠腦微血管內皮細胞株 b.End 3購自ATCC；Transwell培養板 (0.4 μm孔徑，24孔板) 購自Corning；DMEM培養基、RPMI-1640購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；PBS、0.25%胰蛋白酶、結晶紫購自基爾頓生物科技(上海)有限公司；羊抗兔FITC標記 II 抗、羊抗鼠Alexa flour 555標記 II 抗購自碧云天生物科技有限公司；ZO-1抗體購自Santa Cruz；MMP-9抗體購自Abcam；TRIzol購自Invitrogen； RT-PCR 試劑盒購自TaKaRa；MMP-9、 TIMP-1、GAPDH 引物由寶生物工程有限公司合成；異硫氰酸熒光標記的葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran，FD-40)購自 Sigma；其余生化試劑均為進口分裝或國產分析純試劑。

2 實驗方法

2.1 b.End3細胞培養 將b.End3細胞接種于明膠包被的玻片或24孔板的Transwell培養板內培養，培養基為DMEM培養基加入10%胎牛血清、4.5 g/L葡萄糖、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺，在5% CO2、37 ℃培養箱中培養，2～4 d傳代 1 次，倒置相差顯微鏡下每日觀察細胞形態變化。

2.2 模型分組 在培養的第7天細胞已匯合成穩定的單層連接后，按照干預因素不同將模型分為：① 空白對照(control)組：不加任何干預的單層b.End3細胞構成的正常體外BBB模型；② TNF-α組：采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h誘導的BBB炎癥模型；③ IDA50+TNF-α組：采用IDA 50 μmol/L預處理6 h后，再采用TNF-α (10 nmol/L)處理24 h誘導BBB炎癥模型；④ IDA100+TNF-α組：采用IDA 100 μmol/L預處理6 h后，再采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h誘導BBB炎癥模型；⑤ IDA200+TNF-α組：采用IDA 200 μmol/L預處理6 h后，再采用TNF-α (10 nmol/L)干預24 h誘導BBB炎癥模型。

2.3 模型通透性檢測 每次以1×107/L的密度將b.End3細胞懸液約0.3 mL接種于24孔板Transwell培養板內池，并于培養板外池加入培養基1.2 mL，保證培養板內外池兩側液面相等，倒置相差顯微鏡下每日觀察細胞形態變化。利用FD-40通過率檢測培養第7天已匯合成單層穩定連接的細胞層的通透性。FD-40加入膜上層，終濃度為0.1 mg/L。30 min后，收集基底膜上的細胞樣品。利用熒光酶標儀檢測樣品的熒光強度，激發波長490 nm，發射波長520 nm。以上實驗均做3復孔。

2.4 Western blot法檢測ZO-1的表達 取各組培養7 d的b.End3細胞提取總蛋白，定量后-70 ℃保存。取50 μg總蛋白樣品，8 % SDS-PAGE分離蛋白，4 ℃濕轉至PDVF膜上，封閉過夜。加入稀釋的 I 抗ZO-1(1∶1 000)和內參照β-actin(1∶500)，室溫下結合 2 h。TBST洗膜10 min×4次，然后加入稀釋的 II 抗(1∶1 000)，室溫下結合 2 h，再以TBST 洗膜10 min×4次。將膜置于KCTM 化學發光試劑盒中室溫孵育3 min，以X 光膠片曝光成像后用Image J 圖像分析軟件分析各條帶的平均灰度值。

2.5 免疫熒光法檢測ZO-1的表達 將明膠包被過的蓋玻片置于24孔板中，長成單層的細胞用0.25%胰蛋白酶消化、計數，稀釋為5×108/L，接種于蓋玻片上，培養至第7 天，取出培養皿，用PBS(pH 7.4)洗2 min×2次；加入4%多聚甲醛室溫固定15 min；0.5% Triton X-100透明化后，以5% BSA室溫封閉2 h；加ZO-1 I抗(1∶100)，4 ℃過夜；PBS洗滌5 min×2次；然后加 II 抗(1∶500)，37 ℃孵育1 h； PBS洗滌5 min×2次；加入DAPI(1∶100)37 ℃避光1～2 min，PBS洗3 min×4次，用熒光顯微鏡觀察各組細胞染色結果。

2.6 RT-PCR法檢測MMP-9/TIMP-1的mRNA表達 按照TRIzol一步法提取各組細胞總RNA后根據RT-PCR試劑盒說明合成cDNA。MMP-9的PCR引物參考序列號為NM_004994.2，正義鏈為5’-TCAGGGAGACGCCCATTTC-3’，反義鏈為5’-ATTGCCGTCCTGGGTGTAG-3’，產物253 bp；TIMP-1引物參考序列為NM_003254.2，正義鏈為5’-ATTCCGACCTCGTCATCAG-3’，反義鏈為5’-CATTCCTCACAGCCAACAG-3’，產物340 bp；GAPDH參考序列號為NM_001256799.2，正義鏈為5’-CATCATCCCTGCCTCTACTG-3’，反義鏈為5’-TGGGTGTCGCTGTTGAAG-3’，產物258 bp。取正義和反義引物各200 ng和1或2 μL的cDNA按照RT-PCR試劑盒說明組成20 μL的PCR反應體系，PCR反應條件為94 ℃5 min; 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30個循環; 72 ℃ 7 min。取PCR產物5 μL用2%的瓊脂糖凝膠電泳，用Gel Documentation System(Biosens SC6200)凝膠成像系統和Gel-Pro 3.2分析結果，以目的基因與GAPDH的灰度值之比作為反映目的基因mRNA相對水平的指標。

3 統計學處理

所有數據采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較用Student-t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料(發病率)的比較則采用χ2檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 細胞培養及通透性的檢測結果

倒置顯微鏡下觀察培養7 d的b.End3細胞，可見細胞呈長梭形或三角形，細胞排列緊密，單層生長，互不重疊，匯合成片呈鋪路卵石樣結構，具有良好的屏障功能。培養第7天，細胞層對FD-40的通透率較培養第1天的細胞樣品和空白對照(未接種細胞)明顯下降，標志著BBB體外模型的成功制備，見圖1。

Figure 1.The incubation of b.End3 cells and measurement of permeability. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs7 d.

圖1 b.End3細胞培養情況和通透性檢測

2 TNF-α和IDA干預后的各組通透性檢測結果

采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h后誘導的BBB炎癥模型的通透性明顯升高，提示BBB炎癥模型的成功制備。采用IDA 50、100、200 μmol/L預處理6 h后，再采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h誘導BBB炎癥模型時，發現各IDA預處理組模型的通透性均明顯下降，尤其以200 μmol/L作用更明顯，差異具有統計學意義，提示IDA對炎癥導致的BBB破壞、通透性升高具有明顯的改善作用，見圖2。

Figure 2.The permeability of FD-40 in different groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsTNF-α group.

圖2 各組模型對FD-40的通透性檢測

3 ZO-1的 Western blot檢測結果

空白對照組可檢測到較穩定的BBB緊密連接蛋白ZO-1的表達，采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h后誘導的BBB炎癥模型ZO-1的表達明顯減少。采用IDA 50、100 μmol/L預處理后再以TNF-α誘導BBB炎癥模型的IDA50+TNF-α組及IDA100+TNF-α組ZO-1蛋白的表達呈增加趨勢，但無統計學意義。而采用IDA 200 μmol/L預處理后再以TNF-α誘導BBB炎癥模型的IDA200+TNF-α組ZO-1的表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，提示IDA預處理能上調BBB炎癥模型的緊密連接蛋白ZO-1的表達，見圖3。

Figure 3.The protein expression of ZO-1 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsTNF-α group.

圖3 ZO-1 蛋白的Western blot檢測結果

4 ZO-1的免疫熒光檢測結果

空白對照組可見BBB緊密連接蛋白ZO-1主要分布在細胞膜上、表達連續，采用TNF-α(10 nmol/L)

Figure 4.The distribution of ZO-1 in each groups detected by immunofluorescence (×400).

圖4 ZO-1免疫熒光法檢測結果

處理24 后誘導的BBB炎癥模型ZO-1在膜上的表達明顯減少、變得不連續，并進入細胞漿內。IDA50+TNF-α組及IDA100+TNF-α組ZO-1蛋白的分布無明顯變化。而IDA200+TNF-α組中，ZO-1在膜上的表達增加、分布明顯趨向連續，提示IDA 200 μmol/L預處理能改善TNF-α誘導的BBB炎癥模型緊密連接蛋白ZO-1的異常分布，見圖4。

5 MMP-9/TIMP-1的RT-PCR檢測結果

空白對照組可檢測到較低水平的MMP-9的表達，采用TNF-α(10 nmol/L)處理24 h后誘導的BBB炎癥模型MMP-9的表達明顯增加，而TIMP-1的表達明顯降低(P<0.01)。IDA50+TNF-α組MMP-9的mRNA表達呈減少趨勢，但無明顯統計學意義。而IDA100+TNF-α及IDA200+TNF-α組MMP-9的表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)，而IDA各處理組的TIMP-1的表達均無明顯變化，提示IDA預處理能下調BBB炎癥模型的MMP-9的表達，但對TIMP-1的表達無明顯影響，見圖5、表1。

Figure 5.The mRNA expression of ZO-1 detected by RT-PCR.M:marker.

圖5 MMP-9/TIMP-1半定量RT-PCR檢測結果

表1 各組MMP-9/TIMP-1的RT-PCR檢測結果

Table 1.The mRNA expression of MMP-9/TIMP-1 (Mean±SD.n=3)

GroupMMP-9/GAPDHTIMP-1/GAPDHControl0.46±0.03**0.92±0.03**TNF-α0.80±0.020.81±0.02IDA50+TNF-α0.76±0.030.82±0.03IDA100+TNF-α0.68±0.03**0.83±0.03IDA200+TNF-α0.55±0.03**0.84±0.02

**P<0.01vsTNF-α group.

討 論

BBB主要由血管內皮細胞、基膜、膠質細胞組成，膠質細胞可以通過終足與內皮細胞相聯系。其中，內皮細胞間的緊密連接是BBB機能與結構的主要基礎[7]。緊密連接位于連接復合體最頂端的組成部分，是由跨膜蛋白包括咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudins)、連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)、ZOs以及細胞骨架蛋白(主要是微絲蛋白actin)等共同組成的。電鏡下可見到相鄰細胞兩層質膜緊緊靠在一起形成緊密連接，細胞-細胞膜的連接無空隙，如同焊條，發揮著屏障作用。BBB功能失調是MS/EAE的一個重要病理途徑，研究發現，在EAE發病時及MS臨床復發時都存在BBB功能失調，BBB通透性增加導致外周炎癥細胞和炎癥因子向中樞遷移是EAE/MS發病的一個重要環節，BBB的通透性與EAE的嚴重程度呈正相關[1]。但EAE/MS中BBB破壞的機制仍不明確。研究發現EAE/MS中BBB破壞的機制可能與緊密連接的異常如腦微血管內皮細胞膜上ZO-1的表達減少、Claudin-5的缺失或者下調等密切相關[2-4]。EAE/MS時，中樞的炎癥因子如TNF-α等能誘發MMP-9的產生[8]， MMP-9作為最重要的降解BBB的酶，不但能降解基底膜，也能降解BBB緊密連接蛋白ZO-1，導致BBB開放，炎癥細胞和炎癥因子進入CNS誘發MS/EAE[9]。在MS/EAE活動期，MMP-9濃度升高，或者MMP-9與其抑制物TIMP-1的平衡失調導致MMP-9活性明顯增加，被認為是MS/EAE的一個重要活動性標志[10]。并且，研究發現無論是作為MS急性期主要治療藥物的糖皮質激素(glucocorticoid，GC)還是作為MS慢性期主要治療藥物的IFN-β都能下調MMP-9的表達或上調TIMP-1的表達,并無法調節體外BBB 模型的腦血管內皮細胞緊密連接蛋白的表達來降低BBB通透性[11-14]。綜上所述，通過調節MMP-9的表達、腦血管內皮細胞間的緊密連接蛋白的表達降低BBB通透性可能是MS/EAE的重要治療靶點。

我們在前期的研究工作中已發現咪唑2受體配體IDA具有減緩大鼠EAE發病的作用[15-16]，然而該保護作用的機制不甚清楚。而我們在體外實驗中已發現，咪唑克生具有拮抗NMDA受體介導的鈣離子內流、降低谷氨酸興奮毒性的作用[17]。而已有研究發現NMDA受體拮抗劑在動物實驗有改善BBB通透性、減緩EAE發病的作用[18]，在體外實驗中能調節緊密連接蛋白ZO-1 和 occludin的分泌、提高BBB體外模型的屏障功能[19]。因此，我們推斷具有NMDA受體拮抗作用的IDA也可能具有調節緊密連接相關蛋白的表達從而調控BBB通透性的作用。在以上的理論假設的基礎上，我們在近期的在體實驗研究中已經觀察到，給予IDA 2 mg/kg(腹腔注射、2次/d、共15 d)進行干預后，能明顯降低EAE炎癥時異常增高的BBB通透性，增加BBB緊密連接蛋白ZO-1的表達，降低MMP-9的表達，從而減輕小鼠EAE時的BBB破壞，抑制中樞炎癥反應，減緩小鼠EAE的病情[5-6]。為了進一步驗證IDA對EAE的保護作用是否直接繼發于其對BBB的保護作用，本實驗通過體外實驗觀察IDA對體外BBB炎癥模型通透性的直接影響，并通過Western blot法定量檢測緊密連接蛋白ZO-1的蛋白表達量、采用免疫熒光法觀察ZO-1的分布情況并通過RT-PCR法檢測MMP-9/TIMP-1的表達來探討IDA對BBB的直接作用。為了與小鼠動物實驗統一，我們參考國內外文獻采用了小鼠腦微血管內皮細胞系b.End3細胞體外培養建立體外BBB模型[20-21]，并采用MS/EAE時最重要的炎癥細胞因子TNF-α作為炎癥刺激因子誘導建立體外BBB炎癥模型以模擬MS/EAE時BBB的破壞[22]。與既往這些研究結果一致，本實驗顯示培養7 d的b.End3細胞具有良好的屏障功能，能較好地阻隔大分子量物質FD-40(分子量40 000 kD)的通過，ZO-1的Western blot及免疫熒光實驗顯示細胞間能形成穩定、連續的細胞間緊密連接，而RT-PCR結果顯示其能分泌少量的MMP-9及TIMP-1。采用炎癥因子TNF-α處理后，FD-40的通過率明顯增加，提示細胞屏障功能破壞；后續的免疫熒光實驗顯示緊密連接蛋白ZO-1在膜上的表達明顯減少、不連續，Western blot結果顯示ZO-1蛋白表達水平明顯下降，提示細胞間緊密連接破壞，同時RT-PCR結果提示MMP-9的表達明顯升高、TIMP-1表達降低，較好地模擬了EAE時的BBB炎癥破壞[1-4, 10]。采用IDA 50、100和200 μmol/L預處理6 h后均能明顯改善BBB炎癥模型的通透性，且呈現隨劑量增加作用加強的趨勢，以IDA 200 μmol/L的劑量作用最強；IDA 100和200 μmol/L組的MMP-9均明顯降低，而只有IDA 200 μmol/L組能明顯增加ZO-1蛋白的表達、改善TNF-α引起的緊密連接破壞、ZO-1的分布異常，提示IDA改善BBB炎癥模型通透性的作用可能隨劑量增加而增強，其作用機制包括降低MMP-9的表達、增加ZO-1的表達和改善其分布，而具體的劑量效應關系及最合適的體內劑量尚有待進一步的研究探討。

[1] Holman DW, Klein RS, Ransohoff RM. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1812(2):220-230.

[2] Errede M, Girolamo F, Ferrara G, et al. Blood-brain barrier alterations in the cerebral cortex in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2012, 71(10):840-854.

[3] Bennett J, Basivireddy J, Kollar A, et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE[J]. J Neuroimmunol, 2010, 229(1-2):180-191.

[4] Leech S, Kirk J, Plumb J, et al. Persistent endothelial abnormalities and blood-brain barrier leak in primary and secondary progressive multiple sclerosis[J]. Neuropathol Appl Neurobiol, 2007, 33(1):86-98.

[5] Wang XS, Fang HL, Chen Y, et al. Idazoxan reduces blood-brain barrier damage during experimental autoimmune encephalomyelitis in mouse[J]. Eur J Pharmacol, 2014, 736:70-76.

[6] 王新施，曾慶意，朱振國，等. 咪唑克生對EAE小鼠血腦屏障通透性及MMP-9/TIMP-1的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(12):2254-2258.

[7] Liu WY, Wang ZB, Zhang LC, et al. Tight junction in blood-brain barrier: an overview of structure, regulation, and regulator substances[J]. CNS Neurosci Ther, 2012, 18(8):609-615.

[8] 高 穎，蔡定芳. 基質金屬蛋白酶-9與炎癥反應研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2003, 19(8):126-129.

[9] Muroski ME, Roycik MD, Newcomer RG, et al. Matrix metalloproteinase-9/ gelatinase B is a putative therapeutic target of chronic obstructive pulmonary disease and multiple sclerosis[J]. Curr Pharm Biotechnol, 2008, 9(1):34-46.

[10]Kandagaddala LD, Kang MJ, Chung BC, et al. Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice[J]. Exp Toxicol Pathol, 2012, 64(1-2):109-114.

[11]F?rster C, Silwedel C, Golenhofen N, et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system[J]. J Physiol, 2005, 565(Pt 2):475-486.

[12]Harkness KA, Adamson P, Sussman JD, et al. Dexamethasone regulation of matrix metalloproteinase expression in CNS vascular endothelium[J]. Brain, 2000, 123(Pt 4):698-709.

[13]F?rster C, Kahles T, Kietz S, et al. Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND[J]. J Physiol, 2007, 580(Pt3):937-949.

[14]Kuruganti PA, Hinojoza JR, Eaton MJ, et al. Interferon-beta counteracts inflammatory mediator-induced effects on brain endothelial cell tight junction molecules-implications for multiple sclerosis[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2002, 61(8):710-724.

[15]Wang XS, Chen YY, Shang XF, et al. Idazoxan attenuates spinal cord injury by enhanced astrocytic activation and reduced microglial activation in rat experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Brain Res, 2009, 1253:198-209.

[16]朱振國，黃艷君，王新施，等. 咪唑克生對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓GFAP及mRNA表達的影響[J]. 現代實用醫學, 2008, 20(12):925-927,931.

[17]Jiang SX, Zheng RY, Zeng JQ, et al. Reversible inhibition of intracellular calcium influx through NMDA receptors by imidazoline I2 receptor antagonists[J]. Eur J Pharmacol, 2009, 629(1-3):12-19.

[18]Paul C, Bolton C. Modulation of blood-brain barrier dysfunction and neurological deficits during acute experimental allergic encephalomyelitis by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist memantine[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2002, 302(1):50-57.

[19]Neuhaus W, Freidl M, Szkokan P, et al. Effects of NMDA receptor modulators on a blood-brain barrierinvitromodel[J]. Brain Res, 2011, 1394: 49-61.

[20]Kook SY, Hong HS, Moon M, et al. Aβ1-42-RAGE interaction disrupts tight junctions of the blood-brain barrier via Ca2+-calcineurin signaling[J]. J Neurosci, 2012, 32(26):8845-8854.

[21]Qian RZ, Zhang GP, Jin HM, et al. Dual-direction effect of crenulatin on apoptosis of cerebral microvascular endothelial cells and it’s mechanism[J]. Chinese J Pathophysiology, 2005, 21(11):2086-2090.

[22]F?rster C, Burek M, Romero IA, et al. Differential effects of hydrocortisone and TNF alpha on tight junction proteins in aninvitromodel of the human blood-brain barrier[J]. J Physiol, 2008, 586(7):1937-1949.

Effect of idazoxan on permeability of inflammatory blood-brain barrier modelinvitro

WANG Xin-shi, ZHU Pan, ZHU Zhen-guo, XIA Nian-ge, LI Jia, ZHENG Rong-yuan

(DepartmentofNeurology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:zhengry2013@163.com)

AIM: To study the effect of idazoxan on the permeability of inflammatory blood-brain barrier (BBB) modelinvitroand the expression of tight junction protein ZO-1. METHODS:InvitroBBB model was established by murine brain endothelial cell line bEnd.3 incubated for 7 d. The cells were treated with TNF-α (10 nmol/L) for additional 24 h to establish the inflammatory BBB model, which was pretreated with IDA at doses of 50, 100 and 200 μmol/L, respectively. The permeability was measured using fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran (FD-40, MW 40,000), the expression of ZO-1 was detected by Western blot analysis, the distribution of ZO-1 was observed by immunofluorescence, and the mRNA expression of MMP-9/TIMP-1 was measured by RT-PCR.RESULTS: After incubated for 7 d, b.End3 cells converged to be confluent monolayer with low permeability. The inflammatory BBB model induced by TNF-α treatment displayed much higher permeability with decreased expression of tight junction protein ZO-1, destroyed distribution of ZO-1 and increased mRNA expression of MMP-9. When pretreated with IDA, the permeability was greatly decreased, the expression of ZO-1 was greatly increased, the abnormal distribution of ZO-1 was greatly ameliorated and the mRNA expression of MMP-9 was obviously reduced. The effect was most significant in IDA (200 μmol/L)-pretreated group (P<0.01). CONCLUSION: IDA directly acts on brain endothelial cells to reduce the expression of MMP-9, increase the expression of tight junction protein ZO-1 and ameliorate the destroyed distribution of ZO-1 in the inflammatory BBB, thus reversing the abnormally elevated permeability in a inflammatory BBB modelinvitroinduced by TNF-α.

Idazoxan; Blood-brain barrier; Tight junction; ZO-1; Matrix metalloproteinases-9; Tissue inhibitors of metalloproteinase-1

1000- 4718(2015)04- 0669- 06

2015- 01- 07

2015- 03- 16

浙江省自然科學基金資助項目(No. LQ12H09002); 溫州市科技計劃項目(No. Y20140283)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.017

△通訊作者 Tel: 0577-55589361; E-mail: zhengry2013@163.com