CX3CR1參與雷公藤內酯對MPP+帕金森病大鼠多巴胺能神經元的保護作用*

周子懿， 高俊鵬， 向 軍， 陳依萍， 蔡業峰， 羅恩麗△， 蔡定芳△

(1廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東省中醫院腦病一科，廣東 廣州 510120； 2廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院中醫科，廣東 廣州 510180； 3復旦大學附屬中山醫院中西醫結合神經病學研究室，上海 200032)

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CX3CR1參與雷公藤內酯對MPP+帕金森病大鼠多巴胺能神經元的保護作用*

周子懿1▲， 高俊鵬2▲， 向 軍3， 陳依萍3， 蔡業峰1， 羅恩麗1△， 蔡定芳3△

(1廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東省中醫院腦病一科，廣東 廣州 510120；2廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院中醫科，廣東 廣州 510180；3復旦大學附屬中山醫院中西醫結合神經病學研究室，上海 200032)

目的： 探討雷公藤內酯對1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)帕金森病模型大鼠的保護作用及其可能機制。方法: 采用MPP+黑質內注射建立帕金森病大鼠模型。實驗分為假手術組、模型組、雷公藤內酯組及其溶劑對照組，利用酪氨酸羥化酶(TH)免疫熒光強度測定多巴胺神經元存活率、小膠質細胞標記物OX-42免疫熒光強度測定小膠質細胞激活程度、Western blotting測定趨化因子受體CX3CR1表達量。結果: 免疫組化結果表明，MPP+黑質內注射可使模型組OX-42免疫熒光強度增高，DA神經元進行性變性死亡。雷公藤內酯組OX-42免疫熒光強度較模型組低(P<0.01)，TH陽性神經元數量較模型組多(P<0.01)。Western blotting結果提示雷公藤內酯組CX3CR1表達量較模型組低(P<0.05)。結論: 雷公藤內酯對MPP+帕金森病大鼠模型具有神經保護作用，其機制可能與抑制小膠質細胞激活有關，抑制CX3CR1可能是其抑制小膠質細胞的途徑之一。

帕金森病； 小膠質細胞； 雷公藤內酯； 多巴胺能神經元

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常見的神經變性運動障礙疾病，其病理基礎是中腦黑質(substantia nigra，SN)區域多巴胺(dopamine，DA)神經元進行性變性死亡，并引起紋狀體DA含量的下降。現有治療方法雖然可以減輕大部分患者臨床癥狀，但無法阻止或延緩DA神經元的進行性死亡。神經炎癥反應(neuroinflammation)作為一種重要的PD致病因素，正受到越來越多的關注。無論在PD動物模型，還是PD患者中，都存在以小膠質細胞(microglia)激活為特征的神經炎癥反應。小膠質細胞是中樞神經系統(central nervous system，CNS)的固有免疫細胞，其活化后可分泌白細胞介素(interleukin，IL)1β、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)α、趨化因子等，損傷DA神經元，促進神經元變性過程[1-2]。

雷公藤是免疫抑制能力較強的藥物之一，用于治療炎癥與自身免疫疾病在我國已有很長的歷史。在雷公藤提取出的9種有生物活性的化合物中，雷公藤內酯(triptolide)是抗炎及免疫抑制作用較強的單體[3]。本研究擬在1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)-PD大鼠模型中，觀察雷公藤內酯對PD模型鼠小膠質細胞的抑制作用，并從趨化因子受體CX3CR1的角度探討其可能機制。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

清潔級健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重250～280 g，由復旦大學實驗動物中心提供。大鼠飼養在恒溫、通風良好的環境中，每天接受12 h的光照，同時供以充足的食物和水。并在每次實驗前進行環境適應性訓練，以排除應激干擾。實驗中大鼠共分為為假手術組、MPP+模型組、雷公藤內酯組和溶劑對照組。MPP+模型組大鼠僅接受MPP+注射，分別在造模后第0、1、3、7、14、21天進行免疫組織化學及Western blotting檢測。其它各組大鼠分別在第7天進行Western blotting檢測，第21天進行免疫組織化學檢測。

2 試劑和藥品

MPP+、阿樸嗎啡、正常驢血清和抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase， TH)抗體(Sigma)；雷公藤內酯(中國藥品生物制品檢定所，HPLC純度99%)；OX-42抗體和驢抗兔 IgG(Chemicon)；山羊抗CX3CR1 抗體Santa Cruz)。

3 方法

3.1 MPP+-PD大鼠模型的建立及動物給藥 造模藥物MPP+注射劑量參照先前文獻[4]，大鼠麻醉后，將其頭部固定于立體定位儀，緩慢將2 μL MPP+(10 μg)以0.4 μL/min速度立體定向注射入左側SN。假手術組給予生理鹽水2 μL代替MPP+，注射方法同上。模型組大鼠僅接受MPP+注射，雷公藤內酯組于造模后以5 μg/kg劑量用生理鹽水配成0.2 mL腹腔注射，每日 1 次。溶劑對照組給予等量生理鹽水腹腔注射，方法同上。

3.2 免疫組織化學測定與定量分析 大鼠在烏拉坦(1.5 g/kg ip)深度麻醉下，經左心室向升主動脈灌注37 ℃生理鹽水150 mL，然后用4 ℃ 4%的多聚甲醛400 mL固定液灌注固定。灌注完畢立即剝取大腦，置于上述固定液中后固定2 h后置入10%蔗糖溶液中(4 ℃)；4～6 h后換入20%蔗糖，組織塊沉底后，再換30%蔗糖至沉底。利用冷凍切片機(Leica)做大腦冠狀面連續切片，片厚30 μm。漂片于切片保護液中，備用。從切片保護液中隨機挑取大腦薄片，每只大鼠6～8張；0.01 mol/L PBS漂洗，10 min 3次，10%正常驢血清(含0.3 % Triton X-100的0.01 mol/L PBS配制)封閉，4 ℃過夜。兔抗酪氨酸羥化酶(1∶1 000)，或mouse-anti-OX-42(1∶1 000)，4 ℃孵育40 h。0.01 mol/L PBS漂洗10 min 3次。若丹明偶聯的驢抗兔IgG (1∶200)，室溫下避光孵育90 min。0.01 mol/L PBS漂洗10 min 3次，避光。熒光封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察。圖像的采集由Olympus數碼相機和相應軟件Spot Advance完成。由于膠質細胞在激活后發生腫脹變形，既定視野里用細胞計數的方法不足以反映膠質細胞活性的增強，因此應用Leica Qwin 500圖像分析軟件對黑質區域OX-42的免疫熒光強度(OX-42-IR)進行測定。每只動物取6張切片，計算其平均光密度值，作為該例動物的最終光密度。

3.3 DA神經元損傷程度的檢測 參照Vaananen等[5]的方法，利用DA神經元特異性標志酶酪氨酸羥化酶染色計數多巴胺DA神經元。TH是兒茶酚胺能神經元合成兒茶酚胺的特異性限速酶，對TH陽性神經元的定量是判定DA神經元的存活情況的可靠指標，可反映DA神經元變性死亡的程度。采用熒光顯微鏡在40倍視野下對腦片SN pc區域TH陽性神經元進行觀察計數，TH陽性神經元的相對定量可由損傷側(MPP+注射側)TH陽性神經元數量除以損傷對側(非注射側)TH陽性神經元數量，結果用百分比表示，各組間進行比較。

3.4 Western blotting檢測 各組大鼠麻醉后，迅速斷頭取出造模同側中腦部位腦組織，約100 mg左右。將組織置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，剪碎，置于裂解液中, 低溫勻漿，4 ℃、13 000 r/min 離心15 min,取上清。提取蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。取總蛋白20 μg，15%SDS-PAGE分離蛋白，電轉法轉移到NC膜上，NC膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h；CX3CR1 I 抗(1∶2 000)或小鼠抗β-actin(1∶10 000) 4 ℃孵育24 h；辣根過氧化物酶偶聯的驢抗羊 II 抗(1∶5 000)或驢抗小鼠 II 抗(1∶1 000)室溫孵育2 h；化學發光法顯影，掃描。用圖像處理系統對條帶灰度進行分析，以β-actin的表達量作內參照。

4 統計學處理

全部數據采用SPSS 19.0 統計軟件包進行統計分析, 正態分布數據用均數±標準誤(mean±SEM)表示，免疫組織化學結果采用成組樣本的t檢驗(比較2種處理組的差異時)或單因素方差分析跟隨組間t檢驗(one-way ANOVA followed by Holm-Sidakt-test)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 MPP+黑質部位注射可導致小膠質細胞激活、多巴胺能神經元損傷

為了對MPP+注射后小膠質細胞激活程度隨時間的變化情況加以評定，我們分別在造模后的0、1、3、7、14、21 d采用OX-42對小膠質細胞進行標記并觀察。在假手術組中，大鼠黑質區域OX-42著色的小膠質細胞呈現出未被激活的形態，胞體較小，層形足板細長，免疫著色較淺。而對于MPP+模型組，OX-42免疫陽性的小膠質細胞的數量明顯增多，并呈現出被激活時的典型形態特征，胞體明顯增大，層形足板變厚變短。OX-42-IR值在MPP+注射3 d后較基線(第0天時)比較開始明顯升高(P<0.01)，7 d時達到最高峰(P<0.01)，在第14和21 天時略有下降，但與基線時比較仍存在顯著統計學差異(P<0.05)，見圖1A。

通過對TH陽性神經元的測定，我們觀察到黑質MPP+注射可導致同側DA神經元進行性變性死亡。重復測量數據方差分析結果表明，TH陽性神經元存活率隨時間變化的差異有統計學意義(P<0.05)，MPP+注射后第3天時與基線比較開始明顯降低(P<0.05)，在第21天時，即本研究的終點，損傷同側TH陽性神經元的數量減少至對側的(8.60±1.21)%(P<0.05)，見圖1B。

Figure 1.Microglia and dopaminergic neurons in the SN as revealed with OX-42 (A) and TH (B) immunoreactivity， respectively. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vs0 d.

圖1 MPP+損傷同側黑質區域OX-42免疫熒光強度、TH陽性神經元數量的變化情況

2 雷公藤內酯對MPP+-PD大鼠小膠質細胞激活情況和DA神經元存活率的影響

在假手術組大鼠的黑質區域，OX-42的免疫著色較少，在MPP+模型鼠的黑質區域，OX-42免疫陽性的小膠質細胞表現出激活時的典型特征。在雷公藤內酯給藥組中，OX-42-IR值顯著降低，同假手術組比較無顯著統計學差異，見圖2，提示雷公藤內酯系統性給藥可起到抑制小膠質細胞的作用。

對TH陽性神經元的分析顯示，雷公藤內酯可使損傷同側黑質區域TH陽性神經元數量升高到對側的(34.90±5.33)%，顯著高于MPP+模型組(P<0.05)。對于vehicle對照組，其OX-42-IR值和TH陽性神經元百分比同MPP+模型組相比無顯著差異，見圖2。

Figure 2.The effect of triptolide on MPP+-induced microglial activation and dopaminergic neurotoxicity in rats.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham;#P<0.05vsMPP+.

圖2 雷公藤內酯對MPP+-PD大鼠小膠質細胞激活情況及DA神經元存活情況的影響

3 CX3CR1 在MPP+-PD大鼠SN區域表達變化趨勢

CX3CR1蛋白在假手術組的SN區域有一定的表達量，CX3CR1表達量在MPP+造模后第3、7、14、21天均較假手術組升高(P<0.05)，在造模后第7天時升高尤為明顯，而造模后第1天組與假手術組對比差異無統計學意義，見圖3。

4 雷公藤內酯對MPP+-PD大鼠SN區域CX3CR1表達的影響

雷公藤內酯干預組CX3CR1表達量較模型組顯著下降(P<0.05)。vehicle對照組CX3CR1表達量與模型組差異無顯著統計學意義，見圖4。

討 論

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(MPTP)及其活性代謝產物MPP+是目前較常用的PD造模藥物。上世紀80年代在美國北加州吸毒者所使用的海洛因中混有MPTP，可形成與自發性PD難以分辨的癥候群[6]，是目前唯一在人類中發現可導致PD癥狀的神經毒素。然而，當利用MPTP系統給藥造模時，不但會引起DA神經元損傷，還會影響到膠質細胞的功能。因MPTP向MPP+的轉化主要是在星型膠質細胞內單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)-B的催化作用下完成，影響MAO-B功能的藥物可能會加重MPTP的神經毒性[7]，因此，選擇MPP+-PD大鼠作為研究對象，可避免因實驗藥物對星形膠質細胞功能的影響而干擾實驗結果，已成為研究小膠質細胞功能狀態與DA神經元損傷之間關系的理想模型。

Fractalkine/CX3CL1(FKN)是趨化因子亞家族CX3C的成員，正常生理狀態下，FKN以膜分子形式廣泛表達于腦組織的神經元細胞，其受體CX3CR1則主要表達在小膠質細胞膜上[8]，是激活小膠質細胞的重要靶點。Lee等[9]在CX3CR1基因敲除小鼠中發現小膠質細胞活性明顯下降。Shan等[2]用特異性抗體封閉CX3CR1可以減輕小膠質細胞的激活程度，并起到保護多巴胺能神經元的作用。本研究觀察到，在MPP+注射后CX3CR1在第3天后逐漸升高，至第7天達到高峰，這與小膠質細胞激活的時相吻合，進一步印證了CX3CR1在小膠質細胞激活中起到重要作用。抑制CX3CR1的表達或抑制其活性有望成為治療PD的靶點之一。

Figure 3.The expression levels of CX3CR1 in the SN area of MPP+-PD rats at different time points.Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vssham group.

圖3 CX3CR1 在MPP+-PD大鼠SN區域表達變化

Figure 4.The expression of CX3CR1 in different groups after 7 d of MPP+injection. 1: sham group； 2: MPP+group; 3: MPP++ triptolide group; 4: MPP++ vehicle group.Mean±SEM.n=6.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMPP+group.

圖4 MPP+造模后第7天各組CX3CR1表達情況

雷公藤內酯是中藥雷公藤中主要的單體成分，本實驗中，我們觀察到雷公藤內酯可以抑制小膠質細胞的激活，降低TH陽性神經元的死亡率。這些研究結果與雷公藤內酯可以抑制LPS誘導的小膠質細胞激活，保護DA神經元相吻合[10-11]，印證了雷公藤內酯有確切的小膠質細胞抑制作用，可減輕TH神經元的損傷。我們同時觀察到雷公藤內酯可抑制CX3CR1的表達，提示CX3CR1可能是其抑制小膠質細胞的途徑之一。

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CX3CR1 mediates the neuroprotective effect of triptolide on 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced hemiparkinson rats

ZHOU Zi-yi1, GAO Jun-peng2, XIANG Jun3, CHEN Yi-ping3, CAI Ye-feng1, LUO En-li1, CAI Ding-fang3

(1FirstDepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospital,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China;2GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China;3LaboratoryforNeurologicalResearch,TheInstituteofIntegrativeMedicine,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:sciencecn@hotmail.com;doctorcn@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of triptolide on the inhibition of microglial activation in 1-methyl-4-phenyl pyridinium (MPP+)-induced hemiparkinson disease rats. METHODS: The rat model of Parkinson disease was established by intranigral injection of MPP+. The rats were randomly divided into sham group, MPP+group, triptolide group and vehicle group. The survival of dopaminergic neurons was detected by the immunofluorescence of tyrosine hydroxylase (TH) in the substantia nigra (SN). The activation of microglia was determined by immunofluorescence of OX-42 (microglia marker) in the SN. The expression of chemokine receptor CX3CR1 in SN was measured by Western blotting. RESULTS: Intranigral injection of MPP+increased the fluorescence intensity of the microglial marker, and promoted DA neuron degenerative death. Immunohistological analysis showed that the OX-42 density was decreased (P<0.01) and tyrosine hydroxylase (TH) positive neurons were increased in the triptolide group (P<0.01). The expression of CX3CR1 was lower in triptolide group than that in model group (P<0.05). CONCLUSION: Triptolide may improve PA neurons function in MPP+-induced rats through inhibiting CX3CR1 expression and microglial activation.

Parkinson’s disease; Microglia; Triptolide; Dopaminergic neuron

1000- 4718(2015)04- 0659- 05

2014- 10- 22

2014- 11- 27

國家自然科學基金資助項目(No. 81373712)

R363; R741

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.015

△通訊作者 羅恩麗 Tel: 020-81887233； E-mail: sciencecn@hotmail.com; 蔡定芳 Tel: 021-64041990; E-mail: doctorcn@hotmail.com

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