雷帕霉素對小鼠星形膠質細胞體外誘導凋亡的影響*

尹樂樂， 蘇運欽， 黃秀艷, 葉莎莎， 陳 真， 曾耀英△

(暨南大學 1附屬第一醫院臨床檢驗中心, 2生命科學技術學院組織移植與免疫研究中心，廣東 廣州 510632)

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雷帕霉素對小鼠星形膠質細胞體外誘導凋亡的影響*

尹樂樂1,2▲， 蘇運欽1▲， 黃秀艷2, 葉莎莎2， 陳 真2， 曾耀英2△

(暨南大學1附屬第一醫院臨床檢驗中心,2生命科學技術學院組織移植與免疫研究中心，廣東 廣州 510632)

目的： 探討雷帕霉素(rapamycin, Rapa)對小鼠星形膠質細胞體外凋亡的影響。方法：無菌分離并體外培養C57BL/6J幼鼠腦組織星形膠質細胞。通過MTT比色法測定并分析Rapa濃度對幼鼠星形膠質細胞存活的影響； SYTOX? Green熒光染色聯合熒光酶標儀檢測并分析Rapa對H2O2、ionomycin、deferorxamine等誘導劑作用一定時間內細胞存活的影響；DiOC6(3)染色分析Rapa在H2O2氧化應激損傷條件下對星形膠質細胞線粒體膜電勢的影響；分別采用H2DCFDA和MitoSOXTMRed熒光染色聯合流式細胞術檢測Rapa預適應對星形膠質細胞ROS生成以及線粒體內ROS含量的影響。結果：Rapa能促進H2O2以及ionomycin聯合deferorxamine損傷作用下的星形膠質細胞的存活，對線粒體膜電勢有保護作用，可降低H2O2損傷作用下星形膠質細胞ROS的產生并可以維持胞內線粒體ROS的含量在較低水平。結論：Rapa能夠減少細胞內ROS的生成量并降低胞內線粒體內ROS水平；能夠減輕H2O2對細胞線粒體膜的損傷破壞，維護線粒體膜電勢的穩定性，進而對氧化應激損傷介導細胞凋亡有一定的抑制作用。

雷帕霉素； 星形膠質細胞； 細胞凋亡

雷帕霉素(rapamycin, Rapa)作為臨床常見免疫抑制劑，除了用于器官移植以及自身免疫疾病治療外，亦能促進腫瘤細胞自噬，具有抗腫瘤作用[1]。除此之外，Rapa在神經系統疾病方面也有一定的保護作用，能夠顯著改善腦外傷引起的神經功能障礙[2-3]，抑制小膠質細胞的活化，抑制小膠質細胞在低氧誘導下iNOS的表達[4]，對神經退行性病變帕金森病[5]和阿爾茲海默病[6]具有神經保護作用。目前，已有不少研究證實Rapa對實驗性腦缺血損傷具有神經保護作用[7-9]，但從神經支持細胞——星形膠質細胞的角度觀察并研究Rapa對局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠的影響方面少見報導，且相關機制尚不明確。因此，在本研究中，我們選擇以星形膠質細胞為對象，研究Rapa對星形膠質細胞體外凋亡的影響。

材 料 和 方 法

1 主要材料

出生后0～24 h的清潔級C57BL/6J近交系小鼠，雄性，購于廣東省醫學實驗動物中心。

雷帕霉素購自Sigma，經DMSO溶解并稀釋成2 mmol/L儲存液，分裝，-20 ℃保存。臨用前用無菌PBS稀釋成所需工作液濃度；除非另有說明，DMSO在培養體系中總的終濃度小于0.1%；噻唑藍(MTT)、雙氧水(H2O2)、脂多糖(LPS)、重組小鼠IFN-γ、谷氨酸(glutamate，Glu)、離子霉素(ionomycin，Ion)、2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol，2-ME)和L-谷氨酰胺(L-glutamine)均購自Sigma；DMEM/F12 細胞培養液購于Gibco；胎牛血清、SYTOX? Green、2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(H2DCFDA)和MitoSOXTMRed reagent均購自Invitrogen；Griess reagent購自Promega；去鐵胺(deferoxamine，Def)購自Merck。

手術剪、眼科剪和眼科鑷購自中國蘇州手術器械廠；細胞培養板、移液管、離心管、平皿和培養瓶均為Corning產品。流式細胞儀(FACS Calibur)為Becton Dickinson產品；熒光酶標儀(LB941) 為Berthold產品；酶標儀(680型)為Bio-Rad產品。

2 主要方法

2.1 原代星形膠質細胞的分離與體外培養 無菌條件下取出生后0～24 h的清潔級C57BL/6J小鼠的雙側大腦半球，置于5～10 mL DMEM/F12(含10%胎牛血清)培養基的培養皿中。去除嗅球、海馬、基底神經節、腦膜，分離新大腦皮層，并剪碎為約1 mm3方塊。1 500 r/min離心5 min，并將所得細胞懸液分別以孔徑80、10 μm的尼龍膜過濾，去除血管、細胞團塊和碎片。然后再接種于經多聚賴氨酸處理過的培養皿中，每60 mm培養皿接種細胞1×106個。于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。連續培養3 d后，以含10%胎牛血清的DMEM/F12更換培養基，之后每周更換2次。在有血清的培養基培養2周之后，在培養基中加入終濃度為0.25 mmol/L的二丁基環腺苷酸(dBcAMP)以抑制星形膠質細胞的過度增長同時減少巨噬細胞的增殖。另外，將培養基換成neurobasal+2% B27的無血清培養基，以抑制成纖維細胞的增殖干擾，并使星形膠質細胞達98%以上，且其形狀為星形。經流式細胞術檢測發現，最終所獲的細胞中GFAP 陽性表達的細胞(即星形膠質細胞)在85%以上， 而CD11b陽性細胞(即小膠質細胞)在3%～5%之間,見圖1。

Figure 1.The image of purified astrocytes culturedinvitro(×100).

圖1 純化后體外培養的星形膠質細胞

2.2 MTT法檢測Rapa對星形膠質細胞體外細胞存活的影響 調整星形膠質細胞密度為2×109/L， 加入96孔板，每孔180 μL。其分組如下：調零孔(培養基、MTT、DMSO)、control組和Rapa各濃度組，且每組均設3個復孔。置37 ℃、5% CO2條件下培養6～24 h使細胞貼壁。加入各濃度Rapa工作液10 μL使其終濃度分別為0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L 和1 μmol/L并繼續培養24 h。小心吸去上清，加入90 μL 新鮮培養液，再加入10 μL MTT溶液，繼續在細胞培養箱孵育4 h。棄上清，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀490 nm處測量各孔的吸光度值并計算各實驗組中星形膠質細胞的相對存活率。

2.3 SYTOX? Green聯合熒光酶標儀檢測星形膠質細胞死亡速率 調整星形膠質細胞密度為5×108/L后采用96 孔培養板培養。置37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養6～24 h使細胞貼壁。細胞實驗分為control組、Ion組、Ion+Rapa組、H2O2組、H2O2+Rapa組、Ion+Def組以及Ion+Def+Rapa組，每組均設3個復孔。且Rapa給藥組終濃度選擇為0.5 μmol/L。檢測前棄培養板內細胞上清，換加入含終濃度為1 μmol/L SYTOX? Green的Lock’s buffer(含Ca2+)45 μL，Ion+Def組和Ion+Def+Rapa組內加入5 μL Def(終濃度為400 μmol/L)，檢測前棄培養板內細胞上清，換加入含終濃度為1 μmol/L SYTOX? Green的Lock’s buffer(含 Ca2+, 45 μL)。此外， Ion+Def組以及Ion+Def+Rapa組檢測前需加入Def(終濃度為400 μmol/L，5 μL)，然后立即上熒光酶標儀檢測各組平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)且5 min檢測1次。其中激發光波長選擇488 nm，發射光波長選擇520 nm。本實驗初始檢測10 min后，再次取出培養板，每孔另加入5 μL Ionomycin(終濃度為2.5 μmol/L)或H2O2(終濃度為500 μmol/L)再次上熒光酶標儀檢測。平均每5 min檢測1次。最后統計各組的平均熒光強度。

2.4 DiOC6(3)檢測Rapa對星形膠質細胞線粒體膜電勢的影響 利用熒光探針DiOC6(3)檢測星形膠質細胞線粒體膜電勢情況。Rapa同星形膠質細胞孵育培養24 h后，棄細胞培養板內上清液，再用板內PBS清洗細胞后棄上清。然后每孔內分別加入終濃度為20 nmol/L的DiOC6(3)，置37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內避光染色15 min。胰酶快速消化及PBS終止洗滌，1 500 r/min離心5 min后，最后加入200 μL PBS重懸，上流式細胞儀檢測。

2.5 H2DCFDA熒光探針檢測星形膠質細胞內活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成量 利用熒光探針H2DCFDA檢測星形膠質細胞ROS的產生情況。Rapa同星形膠質細胞孵育培養24 h后，棄細胞培養板內細胞上清液，細胞板內用PBS清洗細胞后棄PBS。然后每孔內分別加入H2DCFDA工作液(終濃度為10 μmol/L)置37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內避光染色15 min。經胰酶快速消化及PBS終止洗滌，1 500 r/min離心5 min后，最后加入200 μL PBS重懸，上流式細胞儀檢測。

2.6 MitoSOXTMRed reagent檢測星形膠質細胞的線粒體內ROS的生成量 利用熒光探針MitoSOXTMRed reagent檢測星形膠質細胞線粒體內ROS的產生情況。Rapa同星形膠質細胞孵育培養24 h后，棄細胞培養板內上清液，在細胞板內用PBS洗滌細胞棄上清。然后每孔內分別加入MitoSOXTMRed reagent(終濃度為5 μmol/L)，置37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內避光染色20 min。胰酶快速消化及PBS終止洗滌，1 500 r /min離心5 min后，加入200 μL PBS重懸，上流式細胞儀檢測。

3 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計軟件，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較則采用one-way ANOVA 結合Student-Newman-Keulsq檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度Rapa對星形膠質細胞體外細胞存活的影響

采用MTT法檢測Rapa對星形膠質細胞存活的影響，終濃度分別為0.125、0.25、0.5以及1 μmol/L Rapa同原代星形膠質細胞共孵育24 h后所得細胞存活率分別為(86.15±4.24)%、 (83.34±4.10)%、(82.01±4.07)%以及(81.02±2.71)%，結果表明所選濃度Rapa對星形膠質細胞存活的毒性影響較小，見圖2。

Figure 2.Determination of cell survival rate using the MTT assay after the astrocytes co-cultured with various concentrations of rapamycin for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

圖2 MTT法檢測不同濃度Rapa對星形膠質細胞體外細胞存活的影響

2 Rapa對Ion或H2O2誘導星形膠質細胞死亡的影響

SYTOX? Green是一種綠色熒光染料，與DAPI染色的對象不同：它僅對有細胞膜損傷的非健康細胞(即死亡細胞或瀕臨死亡的細胞)染色，而對健康的活細胞不染色。根據其特性，我們采用SYTOX? Green聯合熒光酶標儀快速檢測細胞平均熒光強度由此分析細胞死亡情況。與control相比，終濃度為2.5 μmol/L的Ion能引起星形膠質細胞快速死亡；而終濃度為0.5 μmol/L Rapa不能阻斷Ion誘導星形膠質細胞死亡的作用。另外，終濃度為500 μmol/L的H2O2長時間作用星形膠質細胞亦能誘導星形膠質細胞死亡，然而，Rapa(0.5 μmol/L)卻能夠降低H2O2誘導星形膠質細胞的死亡速率，見圖3。

Figure 3.The effects of Rapa on the cell death of astrocytes induced by Ion or H2O2. Mean±SD.n=3.

圖3 Rapa對Ion或H2O2誘導星形膠質細胞死亡的影響

3 Rapa對Ion 聯合deferoxamine誘導星形膠質細胞死亡的影響

Deferoxamine能加快Ion誘導星形膠質細胞的死亡速率，Rapa卻能夠長時間拮抗deferoxamine對細胞的作用，明顯降低deferoxamine聯合Ion誘導星形膠質細胞的死亡速率,見圖4。

Figure 4.The effects of Rapa on the cell death of astrocytes induced by Ion or Ion plus Def. Mean±SD.n=3.

圖4 Rapa對Ion 聯合Def誘導星形膠質細胞死亡的影響

4 Rapa對星形膠質細胞線粒體膜電勢的影響

DiOC6(3)作為一種親脂性熒光染料能夠與活細胞線粒體發生結合，其過程依賴于線粒體自身的膜電勢水平。而線粒體膜電勢的變化通常反映線粒體膜穩定性的狀態，一旦線粒體膜穩定性變差，即線粒體膜通透性增高致使細胞趨向發生凋亡。通常流式細胞術結果中DiOC6(3)平均熒光強度左移往往是意味著細胞線粒體膜穩定性變差，致使細胞易于發生細胞凋亡。所以,DiOC6(3)的平均熒光是否發生偏移的結果可以間接反映細胞是否發生凋亡的狀態。本次實驗結果發現與control組相比，單獨Rapa作用于星形膠質細胞能夠增強其線粒體膜電勢(P<0.05)。終濃度為500 μmol/L的H2O2亦對星形膠質細胞線粒體膜電勢有降低作用，與control組相比較差異顯著(P<0.01)。各濃度Rapa在H2O2條件下亦能提高細胞線粒體膜電勢(P<0.01)，見圖5、6。

Figure 5.Flow cytometry analysis was used to determine the effects of Rapa on mitochondrial membrane potential in the astrocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖5 Rapa作用下對星形膠質細胞線粒體膜電勢的影響

5 Rapa對H2O2誘導星形膠質細胞ROS產生的影響

H2DCFDA作為一種活細胞染料，它在進入活細胞膜內能夠被細胞內酯酶作用并轉化生成為H2DCF，而后者對細胞內各類ROS敏感且極容易被其氧化并生成2’，7’-dichloroflurorescein產物。而氧化后產物具有強熒光特性，通常結合熒光顯微鏡或流式細胞術檢測細胞內ROS水平，根據平均熒光強度變化來表示細胞內ROS水平。由此，我們選擇H2DCFDA并結合流式細胞術檢測Rapa預處理對星形膠質細胞ROS水平的影響。其結果表明，H2O2組與control組相比，細胞內ROS水平顯著降低(P<0.01)。同時，在H2O2條件下，各濃度Rapa均可使細胞ROS處于較低水平(P<0.01),見圖7。

Figure 6.The effects of Rapa on mitochondrial membrane potential of astrocytes treated with H2O2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsH2O2.

圖6 Rapa對經H2O2處理對星形膠質細胞線粒體膜電勢的影響

Figure 7.The effects of Rapa on the production of ROS in the astrocytes induced by H2O2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsH2O2.

圖7 Rapa對H2O2誘導星形膠質細胞ROS生成的影響

6 Rapa對H2O2誘導星形膠質細胞線粒體內ROS產生的影響

MitoSOXTMRed是一種新型高選擇性熒光探針，能夠快速高選擇性靶向結合活細胞內線粒體。一旦進入線粒體，MitoSOXTMRed能夠即刻被線粒體內ROS氧化進而表現為紅色熒光。通常結合熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內線粒體ROS水平，可根據平均熒光強度變化來表示細胞內ROS水平。本實驗中采用流式細胞術檢測線粒體ROS水平，各濃度Rapa單獨作用于星形膠質細胞時能降低細胞線粒體內ROS水平(P<0.01)。與control組相比，H2O2組內線粒體內ROS量降低。另外，在H2O2條件下，各濃度Rapa均可使細胞線粒體內的ROS處于較低水平，但與H2O2組相比差異無統計學意義，見圖8。

Figure 8.The effects of Rapa on the mitochondrial production of ROS in the astrocytes induced by H2O2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖8 Rapa對H2O2誘導星形膠質細胞線粒體內ROS生成的影響

討 論

我們已在前期實驗發現Rapa預適應后對實驗性腦缺血再灌注損傷小鼠模型有保護作用[9]。因此，基于上述理論依據，我們在本實驗研究中以星形膠質細胞為研究對象，體外選擇性模擬離子失衡及氧化反應等細胞微環境，從而進行觀察Rapa在體外誘導凋亡作用下對星形膠質細胞的影響。

我們首先在體外培養星形膠質細胞環境中加入ionomycin和H2O2分別模擬不同條件下細胞內Ca2+過載，觀察Rapa預處理后星形膠質細胞對體外誘導細胞死亡的表現。結果顯示，Rapa未能抑制ionomycin直接誘導Ca2+超載引起的細胞死亡，但是卻能夠顯著降低H2O2誘導星形膠質細胞的死亡速率。研究表明，在低濃度條件下，H2O2可介導氧化應激作用破壞線粒體功能，減少細胞內ATP生成量，并依次打開ATP依賴性通道和非特異性陽離子通道進而導致Ca2+內流[10]。由此，我們推測Rapa可能通過影響上述通路進而減緩氧化應激刺激下星形膠質細胞從細胞外攝取Ca2+速度，以及推遲細胞達到離子失衡狀態，進而對氧化應激損傷作用下細胞凋亡有明顯的保護作用。而有關Rapa對細胞內ATP生成影響，以及其對ATP依賴性通道和非特異性陽離子通道的影響作用，還需要我們進一步研究工作加以證實。

接著，我們選用Def進一步模擬氧化應激條件下細胞損傷，繼續觀察Rapa對氧化應激條件下誘導細胞死亡的影響。Def是一種鐵依賴性自由基抑制劑。研究表明，Def能夠誘導細胞內質網應激，增強缺氧條件下PC12細胞內鐵調節蛋白1的表達以及它與內質網膜結合活性[11]。有人發現，內質網應激在一些神經性疾病如帕金森病[12]、阿爾茲海默病[13]以及缺血性腦血管病[14]發生發展過程中可被視為起到關鍵作用。而體內動物實驗表明，抑制內質網應激反應對神經損傷、缺血性腦血管病[15]等具有抑制作用。本實驗結果表明Rapa能明顯降低Def聯合Ion誘導星形膠質細胞的死亡速率。結果提示，Rapa能夠抑制Def對細胞的內質網應激作用，從而間接降低細胞內Ca2+過載引起的細胞死亡。同時，這種保護機制與直接抑制Ca2+內流無關，且有關Rapa對細胞內質網相關信號途徑的影響還有待我們進一步實驗加以研究。

腦缺血再灌注損傷發生發展過程中生成過量活性氧自由基，它們對線粒體內膜造成脂質過氧化反應、使得線粒體膜流動性降低、膜蛋白和脂類發生降解以及線粒體膜的通透性增高進而影響了線粒體內膜電勢，使得線粒體合成ATP的功能發生障礙。線粒體功能障礙又可導致氧自由基生成進一步增多，同時機體內源性抗氧化物酶相對不足而不能全部清除過量的ROS，又可引起生物膜上重要的脂類、蛋白等成分受到破壞，進一步損傷線粒體功能，造成惡性循環，最終引起細胞發生凋亡。總之，氧化應激已成為腦缺血介導神經凋亡的重要因素之一。本研究中，我們通過檢測星形膠質細胞線粒體膜電勢，從側面評價Rapa對氧化應激損傷作用下細胞凋亡的影響。我們選擇DiOC6(3)作為細胞線粒體膜電勢表現的反應。結果表明，單獨Rapa作用于星形膠質細胞能夠增強其線粒體膜電勢；在H2O2氧化應激損傷作用下Rapa亦能提高細胞線粒體膜電勢平均熒光強度，結果提示Rapa具有維護線粒體膜電勢穩定性作用，從而對氧化應激損傷介導細胞凋亡有保護作用。

此外，我們進一步選擇經典氧化應激誘導劑H2O2與星形膠質細胞體外共培養，借以模擬腦缺血再灌注過程中的氧化應激損傷環境。我們選擇 H2DCFDA和MitoSOXTMRed分別檢測細胞和線粒體內ROS生成量，以間接評估Rapa對線粒體功能的作用。本研究結果發現，單獨H2O2能夠誘導大量星形膠質細胞發生死亡，使得細胞外膜以及線粒體膜穩定性受損，膜通透性增加，進而使得細胞在長期H2O2誘導作用下ROS的生成量“漏出”細胞膜或線粒體外，因而FCM結果顯示為H2O2組ROS量相對降低。然而，在Rapa預處理干預作用下，細胞在H2O2條件下存活程度變高，細胞膜和線粒體膜穩定性均得到增強，故而該條件下FCM結果顯示各濃度Rapa預處理組細胞內和線粒體內ROS水平值均維持在較低水平。再聯合單獨Rapa作用靜息狀態下星形膠質細胞線粒體ROS水平結果，整體說明了Rapa能夠有效降低星形膠質細胞內ROS水平。我們推測，Rapa可能參與影響了線粒體呼吸鏈過程的某個環節，進而表現為降低細胞線粒體內ROS的含量。另一方面，Ravikumar等[16]發現Rapa對體外誘導的PC12、NRK、COS-7、CSM-14和HeLa細胞系凋亡有抑制作用。而本實驗結果亦支持上述論斷，但有關Rapa在H2O2誘導細胞凋亡途徑中所參與的保護環節尚未清楚，還需進一步工作加以證實。

綜上所述，Rapa可減少細胞內ROS的生成量，降低胞內線粒體內ROS水平，減輕H2O2對細胞線粒體膜的損傷破壞，并維護線粒體膜電勢的穩定性，進而對氧化應激損傷介導的細胞凋亡有一定的抑制作用。但有關Rapa在H2O2誘導細胞凋亡途徑中所參與的作用途徑和機制極為復雜，還有待我們進一步工作加以研究。

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Effect of rapamycin on apoptosis of mouse astrocytesinvitro

YIN Le-le1, 2, SU Yun-qin1, HUANG Xiu-yan2, YE Sha-sha2, CHEN Zhen2, ZENG Yao-ying2

(1DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospital，2InstituteofTissueTransplantationandImmunology,CollegeofLifeScienceandTechnology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzengyy@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effect of rapamycin on the apoptosis of mouse astrocytesinvitro. ME-THODS: The astrocytes from C57BL/6J newborn mouse pups were isolated and primarily cultured. The effect of rapamycin on the viability of astrocytes was assessed by MTT assay. The mean fluorescence intensity of SYTOX? Green stain in the astrocytes was detected by fluorescence microplate reader in order to analyze the effects of rapamycin on the cell death induced by H2O2, ionomycin and/or deferorxamin. DiOC6(3) staining was used to analyze the mitochondrial membrane potential of the astrocytes induced by H2O2. Flow cytometry analysis was used to determine the production of ROS in the astrocytes and mitochondria by staining with H2DCFDA and MitoSOXTMRed reagent, respectively. RESULTS: Rapamycin at concentration of 0.5 μmol/L protected the astrocytes against cell death induced by H2O2or deferoxamine plus ionomycin. Rapamycin protected the mitochondrial membrane potential of astrocytes from the injury of H2O2. It also reduced the production of ROS in the astrocytes and decreased the level of ROS in the mitochondria. CONCLUSION: Rapamycin reduces the ROS overload in the mitochondria, keeps mitochondrial membrane potential safety and protects the astrocytes against apoptosisinvitro.

Rapamycin; Astrocyte; Apoptosis

1000- 4718(2015)04- 0652- 07

2014- 12 -10

2015- 01- 23

國家自然科學基金資助項目(No.31200667)；暨南大學科研培育與創新基金青年基金(理工醫類)資助項目(No.11614311)

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.014

△通訊作者 Tel： 020-85226219； E-mail： tzengyy@jnu.edu.cn

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