DEC1基因過表達對人食管癌ECA109細胞增殖及侵襲能力的影響

楊純平， 王華川， 溫劍虎

(重慶醫科大學附屬第一醫院胸心外科，重慶 400016)

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DEC1基因過表達對人食管癌ECA109細胞增殖及侵襲能力的影響

楊純平， 王華川， 溫劍虎△

(重慶醫科大學附屬第一醫院胸心外科，重慶 400016)

目的： 探討DEC1基因過表達對人食管癌ECA109細胞增殖和侵襲能力的影響及可能機制。方法：將質粒pcDNA3.1(-)/DEC1(DEC1組)和pcDNA3.1(-)(vector組)利用脂質體分別轉染至人食管癌ECA109細胞中，通過real-time PCR檢測轉染48 h后的細胞內DEC1 mRNA表達，Western blot分別檢測轉染72 h后細胞內DEC1、基質金屬蛋白酶9(MMP9)及細胞周期蛋白cyclin D1的蛋白表達；采用CCK-8實驗、平板集落實驗及Transwell實驗分別檢測DEC1過表達對細胞的增殖和侵襲能力的影響。結果: 與vector組相比，DEC1組中DEC1的表達明顯增高(P<0.01);cyclin D1和MMP9的表達明顯降低(P<0.05)；細胞增殖與侵襲能力明顯受到抑制(P<0.01)。結論：過表達DEC1可明顯抑制ECA109細胞的增殖和侵襲能力，DEC1可能通過影響MMP9和cyclin D1參與其中。

DEC1基因； 食管癌； ECA109細胞； 細胞增殖; 細胞侵襲

食管癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，資料顯示食管癌可能由多種因素致病[1-2]，與患者的年齡、性別、職業、生活環境密切相關，由于缺乏有效的早期診斷及綜合治療，而導致目前食管癌患者總體病死率仍居高不下[3-4]。因此，尋找和開發新的治療食管癌的方法和分子靶點是當前研究的重要課題。

分化型胚胎軟骨發育基因1(differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 1，DEC1)屬于生長發育基因，參與軟骨形成，神經發生，細胞的分化等生理過程，同時還參與了腫瘤的發生與發展，在腫瘤細胞的增殖、凋亡和分化起著重要作用[5-6]。近年來研究發現，DEC1在肺腺癌、乳腺癌和食管癌等多種腫瘤中高表達[7-8]，且與缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α)的表達顯著相關[9]，可能是腫瘤缺氧的直接標志[10]。本研究在此基礎上，將已構建好的DEC1真核過表達質粒轉染至食管癌ECA109細胞中，觀察其對ECA109細胞的增殖和侵襲能力的影響，并探討其可能機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

兔抗人MMP9單克隆抗體購自北京博奧森公司；兔抗人cyclin D1單克隆抗體購自CST；兔抗人DEC1單克隆抗體購自Abcam；actin抗體購自Santa Cruz；HRP標記的羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術有限公司；Total RNA提取試劑盒購自Omega；脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen。

2 細胞培養

人食管癌ECA109 細胞株由我院腫瘤研究中心提供，由含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養液，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，胰酶消化細胞，2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞實驗。

3 實驗方法

3.1 過表達DEC1質粒的構建與轉染 根據DEC1基因在GenBank中cDNA序列(NM_003670.2)設計引物如下：P1：5’-TTTAAGCTTGCCACCATGGAGCG-GATCCCCAG-3’(含HindIII酶切位點);P2：5’-CCGGTCTAGAGTCTTTGGTTTCTAAGT-3’(含XbaI酶切位點)，引物由上海生工生物工程技術公司合成。從ECA109細胞提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，以其為模板進行PCR擴增，切膠回收后，按照Invitrogen公司pcDNA3.1(-)說明書構建重組質粒，轉化DH5α感受態大腸桿菌，挑選轉化子，提取質粒，經酶切和測序鑒定pcDNA3.1(-)/DEC1構建成功。按照脂質體LipofectamineTM2000說明書操作，將pcDNA3.1(-)及pcDNA3.1(-)/DEC1，按質粒與脂質體質量比為1：2轉染入ECA109細胞中，實驗分組為DEC1組[pcDNA3.1(-)/DEC1]和vector組[pcDNA3.1(-)]。

3.2 Real-time PCR檢測轉染細胞中DEC1、cyclin D1和MMP9的mRNA表達水平 將轉染48 h后的vector組和DEC1組細胞提取總RNA，按TaKaRa逆轉錄反應說明書合成cDNA，稀釋10倍后進行real-time PCR，用于擴增DEC1的上游引物為5’-GGCGGGGAATAAAACGGAGCGA-3’，下游引物為5’-CCTCACGGGCACAAGTCTGGAA-3’；β-actin的上游引物為5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’，下游引物為5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。反應條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共39個循環。同一實驗重復3次，實驗數據分析采用2-ΔΔCt法計算。

3.3 Western blot 檢測轉染細胞中DEC1、cyclin D1和MMP9蛋白表達水平 提取各組ECA109細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入5×SDS上樣緩沖液100 ℃ 5 min，每孔40 μg，80 V恒壓SDS-PAGE，250 mA恒流2 h冰浴電轉至PVDF膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，與特異性 I抗(DEC1 1∶2 000，MMP9 1∶1 000，cyclin D1 1∶1 000)4 ℃過夜，II抗孵育2 h后ECL化學發光并顯影。

3.4 CCK-8實驗 將轉染24 h的各組細胞消化收集，按每孔2 000個接種于96孔板中，待細胞貼壁后記為0 h，分別在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h加入10 μL CCK-8液，37 ℃孵育2 h后，在450 nm處測定吸光度。

3.5 平板集落實驗 將轉染24 h的各組細胞消化收集，按每孔1 000個接種于6孔板中37 ℃、5% CO2培養，2～3 d換液，10 d后取出，固定并結晶紫染色。

3.6 Transwell實驗檢測其遷移能力 將Matrigel膠4 ℃過夜后，無血清RPMI1640培養基按8∶1稀釋并混勻，每Transwell小室上室均勻鋪入60 μL混合液，37 ℃孵育2 h，將轉染24 h的各組細胞消化收集并計數，加入含3% 胎牛血清培養基制成細胞懸液，以每孔2 000個(100 μL)加入上室中，下室加入含15% 胎牛血清的培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h，棉簽擦掉上室細胞，PBS洗3次，甲醇固定30 min，結晶紫染色10 min，PBS洗凈，室溫風干，光鏡下隨機選取3個視野計數。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 轉染細胞中過表達DEC1的鑒定

Real-time PCR和Western blot檢測結果顯示，DEC1組DEC1基因的表達水平明顯高于vector組，差異有統計學意義(P<0.01)，表明DEC1組的DEC1過表達,見圖1、2。

Figure 1.The mRNA expression of DEC1 in the ECA109 cells transfected with plasmid pcDNA3.1 (-)/DEC1 (DEC1 group) or pcDNA3.1 (-) (vector group) detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

圖1 Real-time PCR 檢測DEC1 mRNA的表達

Figure 2.The protein expression of DEC1 in the ECA109 cells transfected with plasmid pcDNA3.1 (-)/DEC1 (DEC1 group) or pcDNA3. 1 (-) (vector group) detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖2 Western blot實驗檢測DEC1蛋白的表達水平

2 過表達DEC1對ECA109細胞生長能力的影響

CCK-8實驗結果顯示過表達DEC1基因后，ECA109細胞的生長明顯受到抑制，差異具有統計學意義(P<0.01)，說明過表達DEC1基因抑制了細胞的生長，見圖3。

Figure 3.The growth curve of ECA109 cells transfected with plasmid pcDNA3.1 (-)/DEC1 (DEC1 group) or pcDNA3.1 (-) (vector group) evaluated by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsvector group.

圖3 CCK-8測定過表達DEC1基因對食管癌ECA109細胞生長的影響

3 過表達DEC1對ECA109細胞克隆形成能力的影響

平板集落實驗結果顯示，與vector組相比，DEC1組細胞克隆團數量明顯減少(P<0.01)，說明過表達DEC1后，ECA109細胞的克隆形成能力明顯減弱,見圖4。

Figure 4.Colony-forming capacity of the ECA109 cells transfec-ted with plasmid pcDNA3.1 (-)/DEC1 (DEC1 group) or pcDNA3.1 (-) (vector group) detecded by colony formation assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsvector group.

圖4 平板集落實驗檢測過表達DEC1對ECA109細胞克隆形成能力的影響

4 過表達DEC1基因對ECA109細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗 結果顯示，與vector組相比，DEC1組穿過基底膜的細胞數明顯減少(P<0.05)，說明過表達DEC1后ECA109細胞的侵襲能力減弱,見圖5。

Figure 5.The invasion ability of the ECA109 cells transfected with plasmid pcDNA3.1 (-)/DEC1 (DEC1 group) or pcDNA3.1 (-) (vector group) determined by Transwell invasion assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖5 過表達DEC1基因對ECA109細胞侵襲能力的影響

5 過表達DEC1基因對ECA109細胞cyclin D1和MMP9表達的影響

Western blot檢測結果顯示，DEC1組的cyclin D1和MMP9蛋白表達水平明顯低于vector組(圖6)，說明過表達DEC1基因能抑制cyclin D1和MMP9的表達。

Figure 6.The protein expression of cyclin D1 and MMP9 in the ECA109 cells transfected with plasmid pcDNA3.1 (-)/DEC1 (DEC1 group) or pcDNA3.1 (-) (vector group) determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.

圖6 過表達DEC1對cyclin D1和MMP9蛋白表達的影響

討 論

DEC家族包括DEC1和DEC2, 都是堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix， bHLH)結構的轉錄因子。DEC1基因定位于人類染色體3p25.3-26 上, 大約5.7 kb，包括5個外顯子4個內含子，其啟動子區域包括多個GC盒，5’端區域有包括cAMP 應答元件及多個E-box在內的多個轉錄因子結合位點[11]。DEC1蛋白由412個氨基酸組成，定位于細胞核，廣泛表達于軟骨、肺、腸、脾等大多數正常組織，在腦、胰腺和腎中表達較少[12]。

轉錄因子DEC1在腫瘤中的表達模式存在組織特異性，其表達與腫瘤增殖的關系尚存爭議，一方面研究資料表明在肺癌中沉默DEC1表達可以通過調控cyclin D1的表達進而抑制細胞增殖[8]，而乳腺癌中高表達的DEC1通過下調claudin-1的表達促進乳腺癌細胞的侵襲[7]，因此為了明確DEC1在腫瘤細胞中的生物學作用，深入研究不同腫瘤細胞中DEC1的表達調控模式至關重要。本研究通過過表達DEC1基因后研究其對食管癌的增殖和侵襲能力的影響并探討其可能機制，通過CCK-8和平板集落實驗表明，過表達DEC1基因后食管癌ECA109細胞的生長和克隆形成能力明顯下降，而利用Transwell小室模型在體外模擬腫瘤細胞降解細胞外基質穿過基底膜的遷移過程，實驗表明過表達DEC1使ECA109細胞的遷移能力明顯下降，顯示DEC1在食管癌中可能作為抑癌基因調控食管癌的發生發展。同時我們檢測了過表達DEC1后cyclin D1與MMP9的表達，發現在其蛋白表達水平明顯降低，cyclin D1與MMP9是調控腫瘤細胞增殖與侵襲的重要因子[14]，也是TGF-β信號通路下游的調控因子，研究發現在胰腺癌中DEC1通過影響TGF-β通路進而調控上皮-間質轉換的發生[13]，提示我們DEC1可能通過活化TGF-β信號通路，進而調節食管癌的發生與發展。Xu等[15]在241例食管癌患者研究發現DEC1表達水平與食管癌患者年齡、食管鱗癌的浸潤深度，淋巴結轉移情況及pTNMs密切相關，且與食管癌患者的術后生存率顯著相關，提示DEC1可能作為食管鱗癌的一個潛在預后指標，對其的研究更有助于食管癌的前期診斷與臨床治療。

綜上所述，針對DEC1作為bHLH 類轉錄因子，是否可作為一個腫瘤標志物，能否作為關鍵靶點控制腫瘤發生發展，探尋其自身的表達調控及轉錄調節的機制研究作為今后的實驗重點，而本實驗以DEC1基因對食管癌細胞的增殖、侵襲能力的影響作為主要切入點進行研究，為明確DEC1基因功能及其是否可作為食管癌的治療新靶點提供實驗依據。

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Effect ofDEC1 gene over-expression on proliferation and invasion abilities of human esophageal cancer ECA109 cells

YANG Chun-ping, WANG Hua-chuan, WEN Jian-hu

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:tiger001@163.com)

AIM: To investigate the effect ofDEC1 gene over-expression on the proliferation and invasion abilities of human esophageal cancer ECA109 cells. METHODS: ECA109 cells were transfected with plasmid pcDNA3.1 (-)/DEC1 (DEC1 group) or pcDNA3.1 (-) (vector group). The mRNA and protein levels of DEC1, cyclin D1 and MMP-9 were evaluated by real-time PCR and Western blot, respectively. The effects ofDEC1 over-expression on the proliferation and invasion abilities of the ECA109 cells were evaluated by CCK-8 assay, colony formation assay and Transwell test respectively. RESULTS: The DEC1 expression level in ECA109 cells in DEC1 group was significantly higher than that in vector group (P<0.01), but the levels of MMP9 and cyclin D1 expression were opposite (P<0.01). However, both the proliferation and invasion abilities of ECA109 cells in DEC1 groups decreased significantly as compared with those in vector group (P<0.05). CONCLUSION: The over-expression of DEC1 significantly inhibits the proliferation and invasion of ECA109 cells, which may be involved in the expression of cyclin D1 and MMP9.

DEC1 gene; Esophageal cancer; ECA109 cells; Cell proliferation; Cell invasion

1000- 4718(2015)04- 0620- 05

2014- 11- 20

2015- 01- 20

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.008

△通訊作者 Tel: 023-89011132； E-mail: tiger001@163.com