抵抗素基因啟動子-420C/G、細胞色素P4501A1-MspI多態性與吸煙的交互作用對非酒精性脂肪性肝病的影響

張超賢, 郭李柯

(新鄉醫學院第一附屬醫院 1消化內科，2口腔科，河南 衛輝 453100)

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抵抗素基因啟動子-420C/G、細胞色素P4501A1-MspI多態性與吸煙的交互作用對非酒精性脂肪性肝病的影響

張超賢1△, 郭李柯2

(新鄉醫學院第一附屬醫院1消化內科，2口腔科，河南 衛輝 453100)

目的： 探討抵抗素基因啟動子-420C/G、細胞色素P4501A1- MspI(CYP1A1- MspI)基因多態性與吸煙的交互作用與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的關系。方法: 采用病例-對照研究的方法，以1 200例NAFLD患者及1 200例健康對照者的外周血白細胞為樣本，利用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)技術分析了抵抗素基因啟動子-420C/G和CYP1A1- MspI基因多態性。結果: -420C/G (GG)基因型和CYP1A1- MspI(m2/m2)基因型頻率分布分別為49.75%、50.08%(病例組)和24.00%、24.25%(對照組)，兩者經χ2檢驗差異顯著(P<0.01)。-420C/G (GG)基因型者患NAFLD的風險顯著增加。CYP1A1- MspI (m2/m2)基因型者患NAFLD的風險也顯著增加。基因突變的協同分析發現-420C/G (GG)/ CYP1A1- MspI (m2/m2)基因型者在NAFLD組和對照組中的分布頻率分別為39.83%和12.83%，兩者經χ2檢驗有顯著差異(P<0.01)。-420C/G (GG)/ CYP1A1- MspI (m2/m2)基因型者患NAFLD的風險顯著增加。病例組的吸煙率顯著高于對照組的吸煙率(P<0.01)，吸煙與-420C/G (GG)和CYP1A1- MspI (m2/m2)基因型均有交互作用。結論: -420C/G (GG)、CYP1A1- MspI (m2/m2)基因型和吸煙是NAFLD的易患因素，基因多態性與吸煙的交互作用增加了NAFLD的發病風險。

非酒精性脂肪性肝病； 抵抗素基因啟動子-420C/G； 細胞色素P4501A1-MspI； 基因多態性； 吸煙

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的確切發病機制目前尚不清楚，以二次打擊學說較為流行，該學說認為胰島素抵抗會導致肝臟脂肪沉積，成為NAFLD發病過程中的一次打擊，而在肝臟脂肪沉積基礎上所發生的氧化應激和脂質過氧化反應則形成二次打擊，最終導致NAFLD的發生[1-4]。香煙以燃燒過程中生成的尼古丁、3，4-苯并芘、一氧化碳等干擾脂質代謝，激發自由基及活性氧生成，促進脂質過氧化而參與NAFLD的發生、發展[5]。抵抗素(resistin)是一種主要由白色脂肪細胞分泌的肽類，其作用是對抗胰島素的效應，引起胰島素抵抗，并且具有潛在炎性因子活性，是促進NAFLD的進展的重要因素[6-7]。細胞色素P450酶(cytochromes P450, CYP450)是一類參與內源性和外源性化合物代謝的酶, 其1A1亞型(CYP1A1)是參與氧化應激和脂質過氧化過程中的關鍵酶，對 NAFLD的發生及發展起著重要作用[8]。抵抗素、CYP1A1基因具有多態性，即具有多個等位基因，不同的等位基因編碼的抵抗素或谷胱甘肽過氧化物酶活性有差異。從理論上推斷抵抗素或CYP1A1基因的多態性可使機體對外界環境(如吸煙)的反應能力有所不同，這是決定機體NAFLD易感性的一個重要因素。抵抗素、CYP1A1基因多態性與NAFLD易感性的研究日漸增多[9-10]，但尚未見吸煙與上述基因多態性的聯合作用對NAFLD易感性影響的報道。為了研究抵抗素和谷胱甘肽過氧化物酶在豫北地區當地人群中的分布狀態，進而探索其和吸煙習慣相互作用與NAFLD高發的關系,我們在國內首次開展了抵抗素和CYP1A1聯合基因多態性與NAFLD易感性關系的研究。

材 料 和 方 法

1 研究對象及相關資料

2010年5月～2013年7月在我院門診和病房診治的NAFLD患者1 200例，NAFLD的診斷參照中華醫學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組的診斷標準[11]。對照組1 200例為健康體檢人群，排除2型糖尿病、肥胖、高血壓、高脂血癥及其它代謝性疾病，排除飲酒史。2組在年齡、性別、民族和籍貫無顯著差異，無血緣關系，吸煙狀況本文分為不吸煙者、吸煙者(將每天1～5支，持續3年以上或每天5支以上持續1年以上定義為吸煙者)。每人各抽取靜脈血2～3 mL，置乙二胺四乙酸鈉抗凝管, 分離白細胞層。用QIAampDNA提取試劑盒(QIAgen)提取白細胞DNA，DNA置-30℃低溫冰箱保存備用。

2 基因測定

2.1 抵抗素基因啟動子-420C/G多態性分析[12]上游引物序列為5’-GTTTGCATCAGCCACCCT-3’，下游引物序列為5’-GCACCGCAGCTCTTTCTT -3’ (由上海生工生物技術有限公司合成)，PCR反應體系包括基因組DNA 1 μL,上、下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶Mix液(TaKaRa)25 μL。反應條件為94 ℃ 5 min；94℃ 45 s， 55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個循環；最后72 ℃ 7 min。PCR產物長度為286 bp，經Bio-Rad染色瓊脂糖凝膠電泳確認擴增結果后，以限制性內切酶EarⅠ酶切，37 ℃孵育4 h，取酶切產物4 μL經Bio-Rad染色瓊脂糖凝膠電泳后，酶切產物放入紫外線凝膠成像儀觀測，可見3種帶型: CC純合子為179 bp和107 bp的2條區帶，GG純合子為286 bp的1條區帶，CG雜合子為286 bp、179 bp和107 bp的3條區帶，見圖1。

Figure 1.The PCR product electrophoretogram of resistin gene promoter -420C/G. M: marker; Lane 1, 2: G/G; Lane 3, 4: C/G; Lane 5, 6: C/C.

2.2 CYP1A1-MspI多態性分析[13]引物序列為5’-CAGTGAAGAGGTGTAGCCGCT-3’和5’-TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT-3’(由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。PCR反應體系總量25 μL,包括10×緩沖液2.5 μL、1 mmol/L dNTP 2.5 μL、引物各15 pmol、TaqDNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2 μL(Promega)。擴增參數為94 ℃ 4 min；94 ℃40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，循環35次；72 ℃ 7 min。取PCR擴增產物5 μL于1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳1 h，溴化乙錠(ethydium bromide，EB)染色30 min，紫外分析儀觀察PCR擴增結果。電泳板瓊脂糖由大連寶生物工程有限公司生產。取PCR產物10 μL,加入MspI內切酶(TaRaKa)，酶切反應體系總量30 μL,包括PCR產物10 μL、10×反應緩沖液2 μL、MspI內切酶10 U，37 ℃ 3 h。酶切后產物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳1 h，EB染色30 min，分析結果。酶切后分為3種基因型：野生型(m1/m1)為340 bp單一條帶，雜合型(m1/m2)為340、200、140 bp 3條區帶，突變純合型(m2/m2)為200、140 bp 2條區帶,見圖2。

Figure 2.The PCR product electrophoretogram of CYP1A1 gene digested with Msp I restriction enzyme. M: marker; Lane 1, 2: m1/m2; Lane 3, 4: m2/m2; Lane 5, 6: m1/m1.

3 統計學處理

Hardy-Weinberg平衡檢驗研究樣本的群體代表性 ，以P>0.05為符合 Hardy-Weinberg規律。用比值比(OR)值和95%可信區間 (95% CI)評價相對風險，病例組和對照組之間的基因型頻率和等位基因頻率采用2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。條件Logistic回歸模型分析交互作用；根據Khoury等[14]提出的交互作用模型和交互系數(γ=βeg/βe)判斷基因-環境交互作用模型以及交互作用類型。判定依據1： γ>1，表示基因對環境暴露的效應有放大作用，正向交互作用；γ<1，表示基因對環境暴露的效應有減弱作用，負向交互作用； γ=1，表示基因對環境暴露沒有交互作用。在病例對照研究中，γ 為兩變量lgOR的比值。判定依據2：OReg=ORe×ORg為相乘模型；OReg>ORe×ORg為超相乘模型；OReg

結 果

1 NAFLD組和對照組的一般資料分析

如表1所示，NAFLD組和對照組性別、年齡分布無顯著差異；NAFLD組吸煙率顯著高于對照組，差異有統計學意義。

表1 NAFLD組和對照組的一般資料

**P<0.01vscontrol group.

2 抵抗素基因啟動子-420C/G和CYP1A1-MspI基因型、等位基因頻率及相關遺傳模型關聯分析

經Hardy-Weinberg 平衡檢驗，-420C/G各基因型在對照組中的分布均符合Hardy-Weinberg 規律(P>0.05)，說明研究群體具有代表性(表2)。CC+CG、 GG基因型頻率在病例組和對照組有顯著差異(P<0.01)；等位基因G在NAFLD組和對照組之間的分布差異具有統計學意義(P<0.01)，且OR值大于1，說明含等位基因G的個體發生NAFLD 的風險相對較高；采用顯性和隱性2種遺傳模型進行分析發現在隱性模型中，兩位點的不同基因型在病例、對照組之間的分布差異均具有統計學意義(P<0.01)，說明GG純合型個體具有NAFLD 易感性。結果表明：-420C/G(C→G突變)可能增加NAFLD的患病風險(表2)。CYP1A1-MspI 3種基因型、等位基因頻率及相關遺傳模型關聯亦符合上述規律(表3)。

3 抵抗素基因啟動子-420C/G和CYP1A1-MspI基因多態性NAFLD發病中的交互作用

-420C/G (GG)/ CYP1A1-MspI(m2/m2)在NAFLD組占39.83%，而對照組僅占12.83%，-420C/G (GG)和CYP1A1-MspI(m2/m2) 在NAFLD發病中存在正向交互作用，交互系數γ1=β1*2/β2=3.3250和γ2=β1*2/β1=3.3385均大于1，OR1*2>OR1×OR2為超相乘模型(表4)。

表2 抵抗素基因啟動子-420C/G基因型與等位基因分布及其遺傳模型分析

aAdjusted according to age, gender and smoking status.

表3 CYP1A1- MspI基因型與等位基因分布及其遺傳模型分析

aAdjusted according to age, gender and smoking status.

表4 抵抗素基因啟動子-420C/G和CYP1A1- MspI多態性在NAFLD發病中的交互作用

aAdjusted according to age, gender and smoking status;bOR value by simple CYP1A1- MspI homozygous mutants exposure (OR1);cOR value by simple -420C/G homozygous mutants exposure (OR2);dOR value by 2 interacting genes in homozygous mutant (OR1*2).

4 抵抗素基因啟動子-420C/G、CYP1A1-MspI多態性與吸煙在NAFLD發病中的交互作用

攜帶-420C/G (CC+CG) 基因吸煙者ORe為1.4225(95% CI：0.9965～2.4670)，單獨攜帶-420C/G (GG)型的ORg為1.3195(95% CI：0.9327～2.6453)，兩者同時存在時，交互作用OReg為5.5270(95% CI：3.3347～7.6040)，交互系數γ=βeg/βe=3.9190>1，OReg>ORe×ORg為超相乘模型(表5)。攜帶CYP1A1-MspI (m2/m2)者同時吸煙交互作用OReg為5.5191(95% CI：3.6901～7.1052)，交互系數γ=βeg/βe=3.9284>1，OReg>ORe×ORg為超相乘模型(表6)。

表5 抵抗素基因啟動子-420C/G多態性和吸煙在NAFLD發病中的交互作用

aAdjusted according to age and gender;bOR value by simple smoking exposure (ORe);cOR value by simple homozygous mutant type exposure (ORg);dOR value by the interaction of smoking and homozygous mutant (OReg).

表6 CYP1A1-MspI多態性和吸煙在NAFLD發病中的交互作用

aAdjusted according to age and gender;bOR value by simple smoking exposure (ORe);cOR value by simple homozygous mutant type exposure (ORg);dOR value by the interaction of smoking and homozygous mutant (OReg).

討 論

抵抗素是一種由脂肪細胞特異分泌的多肽類激素。與代謝密切相關，可減弱脂肪細胞、骨骼肌細胞以及肝細胞對胰島素的敏感性，是導致肝臟胰島素抵抗、促進肝臟脂肪沉積的的一種重要細胞因子[15-17]。抵抗素γ的表達受基因的控制和環境因素的誘導，其表達和誘導表達水平均有顯著個體差異。人抵抗素基因定位于19p13.2，內含子邊界序列均高度保守，其mRNA含476 個堿基對，其編碼區含有326個堿基對，編碼108個氨基酸。人的抵抗素基因存在多種單核苷酸多態性現象，如-420C/G、+299 G/A和-638G/A等。其中-420C/G 被認為是影響抵抗素基因表達的主要多態性位點，可影響啟動子的活性，增加血液和組織中抵抗素的表達，從而影響其生物學效應。抵抗素基因-420C/G多態性具有3種基因型: -420C/G(CC)、-420C/G(CG)和-420C/G(GG)，國內外已有研究報道認為-420C/G位點的多態性與代謝綜合征有關[18-19]。本研究發現-420C/G(GG)基因型者發生NAFLD的風險顯著增加，其OR等于3.1351， 95% CI為1.9255～5.3184。與上述研究結果一致。-420C/G(GG)基因型者易患NAFLD的機理還不清楚，相關研究顯示G等位基因可能通過活化抵抗素基因轉錄過程，增加抵抗素表達，降低胰島素敏感性[20]，從而最終引起肝臟內脂質沉積，增加NAFLD發生的危險性。

在非酒精性脂肪肝的兩次打擊學說中, CYP1A1介導的脂質過氧化發揮重要的作用, 其作用機制與肝細胞內微粒體氧類物質和自由基的生成有關。肝細胞內蓄積游離脂肪酸可誘導CYP1A1 活性增加，促進微粒體氧應激，隨著CYP1A1 表達的增強，抗氧化劑(如SOD、GSH、維生素E)的含量均顯著下降。由于脂質過氧化反應的增強而抗氧化能力下降，導致自由基的生成增多。自由基氧化細胞膜的脂質和蛋白質最終導致肝細胞結構與功能的損害可造成肝毒性和線粒體的損傷，同時由CYP1A1 產生的活性氧通過擴散作用，激活肝星狀細胞形成肝纖維化[21]。CYP1A1基因定位于人類染色體15q 22224，包含7個外顯子和6個內含子。CYP1A1的表達受基因的控制和環境因素的誘導，其本底表達和誘導表達水平均有顯著個體差異。其3′端非翻譯區的T6235C置換產生1個MspⅠ酶切位點即MspI多態性，突變基因的存在可能是通過與該基因調節區其它多態性的連鎖而影響CYP1A1的誘導性。CYP1A1不僅因介導脂質過氧化反應在NAFLD進展中發揮重要作用，而且同時是參與藥物、毒物、前致癌物代謝主要Ⅰ相代謝酶，大多數環境致癌物在體內都需要CYP1A1代謝激活后才有致癌性， 所以在理論上因CYP1A1基因變異導致CYP1A1轉錄或活性增強皆有可能增加惡性腫瘤和NAFLD的易感性。國內外已有研究報道認為MspI位點的多態性與膽囊癌、肺癌等腫瘤的易感性有關[22-23]。MspI多態性具有3種基因型: 野生型(m1/m1)、雜合型(m1/m2)、突變純合型(m2/m2)，本研究發現CYP1A1(m2/m2)基因型者發生NAFLD的風險顯著增加，與上述研究結果一致。CYP1A1(m2/m2)基因型者易患癌或NAFLD的機理還不清楚，相關研究證明m2基因型的酶活性高于m1基因型[24]。因此，m2/m2純合子易患癌或NAFLD的原因可能是此種基因型者體內CYP1A1活性高，可發揮更大的促脂質過氧化或促致癌物形成作用。

本次研究應用Khoury等[14]交互作用模型理論，探詢抵抗素基因啟動子-420C/G和CYP1A1-MspI多態性與吸煙的交互作用，及其對NAFLD發生的意義。本研究發現-420C/G與CYP1A1-MspI突變型的交互作用增加了NAFLD的發病風險。-420C/G (GG) 和CYP1A1-MspI (m2/m2)基因型對NAFLD的發生風險有相互放大效應；通過對吸煙狀況的分析發現，吸煙者患NAFLD的風險明顯高于不吸煙者；吸煙與-420C/G(GG)和CYP1A1-MspI (m2/m2)基因型的交互作用OR值分別為5.5270、5.5191，γ值分別為3.9190、3.9284，均明顯大于1，提示-420C/G(GG)和CYP1A1-MspI(m2/m2)基因型與吸煙暴露在NAFLD發生中均有正向交互作用，攜帶-420C/G(GG)或和CYP1A1-MspI (m2/m2)基因型者吸煙的危害效應更大；兩基因型與吸煙暴露交互作用OReg均大于ORe×ORg，顯示上述兩純合突變基因與吸煙交互作用機制在NAFLD發生中可能為超相乘模型。長期吸煙可使細胞內葡萄糖代謝的氧化與非氧化通路顯著減弱，脂肪組織氧化增多，血漿游離脂肪酸水平升高，而游離脂肪酸又可被肝臟和脂肪組織攝取而合成甘油三酯，從而發生中心脂肪堆積形成腹型肥胖，導致胰島素抵抗的發生。煙草中的尼古丁還會引起交感神經系統興奮，導致兒茶酚胺和其它升糖激素釋放增多，而兒茶酚胺是胰島素作用的強效拮抗劑，它通過損傷胰島素的信號轉導通路和內在活性，使葡萄糖轉運蛋白合成減少，從而使胰島素作用減弱，為NAFLD發病過程中的第一次打擊創造了條件[25-26]。通常情況下生物體內的活細胞均可產生氧自由基，因存在著包括GPx-1在內的自由基清除系統，可及時清除體內過剩的自由基，維持自由基的動態平衡，香煙含多種化合物，多環類的苯并芘能接受電子而形成自由基，另香煙煙氣中有一氧化碳、二氧化碳、一氧化氮、烷基和烷氧基等多種有害自由基。長期吸煙的人，過量氧自由基通過血液進入肝細胞，促使肝細胞發生脂質過氧化及啟動新的自由基反應，最終導致脂肪肝。這可能是吸煙可單獨增加及與抵抗素基因啟動子-420C/G (GG)、CYP1A1-MspI (m2/m2)協同增加NAFLD發生風險性的重要原因。

NAFLD是涉及環境因子和多種基因相互作用的復雜過程，本研究提示攜帶抵抗素基因啟動子-420C/G和CYP1A1-MspI (m2/m2)突變基因型的個體屬NAFLD高危險人群, NAFLD防治方案中應加以重視，雖然尚不能通過改變其NAFLD易感的基因型來防治NAFLD，但可以根據其與環境病因相互作用的特點，采取相應的控制環境病因的措施如戒煙或基因調控以達到有效預防NAFLD的目的。

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Interaction of polymorphisms in resistin gene promoter -420C/G, cytochromes P4501A1 gene MspI and cigarette smoking on nonalcoholic fatty liver disease

ZHANG Chao-xian1, GUO Li-ke2

(1DepartmentofGastroenterology,2DepatmentofStomatology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Weihui453100,China.E-mail:nn21882001@aliyun.com)

AIM: To investigate the interaction of polymorphisms of resistin gene promoter -420C/G, cytochromes P4501A1-MspI and cigarette smoking in nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). METHODS: The genetic polymorphisms in resistin gene promoter -420C/G and CYP1A1-MspI were analyzed by the technique of polymerase chain reaction (PCR) in peripheral blood leukocytes of 900 NAFLD cases and 900 healthy persons. RESULTS: The frequencies of -420C/G (GG) and CYP1A1-MspI (m2/m2) were 49.75% and 50.08% in NAFLD cases and 24.00% and 24.25% in healthy controls, respectively. Statistical tests showed a significant difference in the frequencies between the 2 groups (P<0.01). The risk of NAFLD with -420C/G (GG) was significantly higher than that of controls. Individuals who carried with CYP1A1-MspI (m2/m2) had a high risk of NAFLD. Combined analysis of the polymorphisms showed that the percentages of -420C/G (GG)/CYP1A1-MspI (m2/m2) in NAFLD and control groups were 39.83% and 12.83%, respectively (P<0.01). The people who carried with -420C/G (GG)/CYP1A1-MspI(m2/m2) had a high risk in NAFLD group. The cigarette smoking rate in NAFLD group was signi-ficantly higher than that in control group (P<0.01), and the statistic analysis suggested an interaction between cigarette smoking and -420C/G (GG) and CYP1A1-MspI (m2/m2), which increased the risk of NAFLD.CONCLUSION: -420C/G (GG), CYP1A1-MspI (m2/m2) and cigarette smoking are the risk factors in NAFLD. The interactions between genetic polymorphisms in -420C/G, CYP1A1- MspI (m2/m2) and cigarette smoking increase the risk of NAFLD.

Nonalcoholic fatty liver disease; Resistin gene promoter -420C/G; Cytochromes P4501A1-MspI; Genetic polymorphism; Cigarette smoking

1000- 4718(2015)03- 0485- 07

2014- 09- 30

2014- 12- 05

R363; R575

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.018

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