IL-1β通過PI3K/Akt/mTOR途徑促進神經元活化*

甘 娜， 尹 飛， 彭 鏡， 吳麗文， 何 芳， 陳 晨

(1廣西衛生職業技術學院臨床醫學教研室， 廣西 南寧 530021； 2中南大學湘雅醫院兒科，湖南 長沙 410008)

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IL-1β通過PI3K/Akt/mTOR途徑促進神經元活化*

甘 娜1, 2， 尹 飛2△， 彭 鏡2， 吳麗文2， 何 芳2， 陳 晨2

(1廣西衛生職業技術學院臨床醫學教研室， 廣西 南寧 530021；2中南大學湘雅醫院兒科，湖南 長沙 410008)

目的： 觀察白細胞介素-1β(IL-1β)刺激對神經元活化的影響。方法: 利用IL-1β刺激體外培養的原代神經元，運用慢病毒轉染shRNA使PI3K的p85亞基(PI3K-p85)沉默、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抑制劑雷帕霉素預處理阻斷mTOR、酪氨酸激酶家族抑制劑PP2抑制p85向IL-1受體I型(IL-1RI)募集等方式預處理神經元，檢測PI3K-p85、與IL-1RI結合的PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K以及微管相關蛋白2(MAP2)在神經元內的變化及相互作用；利用FM4-64染色觀察各組神經元突觸胞吞情況。結果: 利用IL-1β刺激體外培養的海馬神經元可增加細胞內PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K、MAP2以及與IL-1RI結合的PI3K-p85的水平(P<0.05)，并且神經元突觸的胞吞作用明顯加劇(P<0.05)；抑制PI3K-p85可以下調IL-1β所致的p-Akt、p-p70S6k和MAP2水平增加(P<0.05)，神經元突觸的胞吞作用減弱(P<0.05)；抑制mTOR也能下調IL-1β所致的PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K和MAP2水平增加(P<0.05)，神經元突觸的胞吞作用減弱(P<0.05)；抑制p85亞基與IL-1RI的結合也可以下調IL-1β所致的p-Akt、p-p70S6K和MAP2水平增加(P<0.05)。結論: 促炎因子IL-1β通過IL-1RI與PI3K-p85結合使PI3K-p85活化，進而磷酸化Akt和mTOR下游物質p70S6K，促進神經元突觸增生及活化，這可能是內側顳葉癲癇向慢性化進展的機制之一。

白細胞介素-1β； 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白； 內側顳葉癲癇； 神經元活化

內側顳葉癲癇(medial temporal lobe epilepsy，MTLE)發生及發展以漸進和持續增加驚厥發作概率為特點[1]，其典型病理改變之一是神經元活化至軸突發芽，顯微鏡下可觀察到海馬區苔蘚樣出芽，我們已經在MTLE模型鼠慢性期海馬內觀察到了明顯的苔蘚纖維增生[2]，而神經元如何活化具體原因不明。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一個新型的絲/蘇氨酸蛋白激酶，該途徑在調節蛋白質合成和其它與生長有關的細胞過程有著廣泛的作用[3]。研究發現，mTOR與癲癇發病的關系密切。

促炎因子IL-1β被認為與癲癇發生有密切相關性[4-5]。通過對局灶性皮質發育不良患者以及癲癇持續狀態鼠模型的研究發現，兩者的大腦內均觀察到IL-1β和mTOR的活化[6-7]；在顳葉癲癇動物模型以及藥物抵抗海馬硬化患者也可觀察到顯著的mTOR活化[8]；我們之前的研究中也證實MTLE病程中伴有IL-1β的表達變化[2]，但目前并沒有關于IL-1β與mTOR在MTLE發生過程中相關性的報道。本研究我們將嘗試揭示IL-1β及mTOR信號途徑在MTLE進展中的作用。

材 料 和 方 法

1 神經元的培養、分組及干預

無菌條件下取出生后48 h內的新生SD鼠海馬，經剪碎、胰酶消化、吹打制成單細胞懸液后，置于含10% FBS的DMEM/F12培養基中，于5% CO2、37 ℃培養箱內進行培養，4～6 h后棄培養基，換成Neurobasal+B27+Glutmax無血清混合培養基繼續培養。以后每周2～3次半量換液。

將原代神經元接種于12孔培養板，培養至第3天，按照吉凱生物公司慢病毒試劑盒說明書提供的操作流程進行慢病毒轉染，感染復數100，進行轉染，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率，并進行下一步干預及檢測。

神經元分組I為: ① 對照組(control組)：正常培養的神經元，不進行任何特殊干預；② IL-1β刺激組(IL-1β組)： 神經元經20 μg/L IL-1β刺激2 h；③ 慢病毒轉染+ IL-1β組[IL-1β+PI3K(-)組]：神經元先經慢病毒轉染，細胞內PI3K的p85亞基(PI3K-p85)表達及功能被干擾抑制后，再予20 μg/L IL-1β刺激2 h；④ IL-1β+雷帕霉素(rapamycin，RaPa)組(IL-1β+Rapa組)：90 μg/L rapamycin預處理24 h，最后予20 μg/L IL-1β刺激2 h ；⑤ 慢病毒轉染+rapamycin預處理+IL-1β組[IL-1β+PI3K(-)+Rapa組]：神經元先經慢病毒轉染，再予90 μg/L rapamycin預處理24 h，最后予20 μg/L IL-1β刺激2 h。

分組II為：① 對照組(control組)：正常培養的神經元，不進行任何特殊干預；② IL-1β刺激組(IL-1β組)：神經元經20 μg/L IL-1β刺激2 h；③ 酪氨酸激酶家族抑制劑PP2預處理+IL-1β組(PP2+IL-1β)：神經元經10 mmol/L PP2干預2 h后，再予20 μg/L IL-1β刺激2 h。

2 主要實驗方法

2.1 Western blotting檢測神經元內PI3K-p85、p-Akt、磷酸化核糖體蛋白S6激酶(phosphorylation ribosomal protein S6 kinase, p-p70S6K)、微管相關蛋白 2(microtubule-associated protein)水平的變化 取分組I各組細胞總蛋白，以20 μg上樣量于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜，封閉后分別與I抗PI3K-p85(1∶1 000，Abcam)、p-Akt(1∶1 000，Cell Signaling)、p-p70S6K(1∶250，Abcam)、MAP2(1∶1 000，Cell Signaling)混合，4 ℃孵育過夜，與適當稀釋濃度的HRP標記的相應II抗(Jackson)室溫孵育1 h后ECL試劑發光、顯影和定影。以β-actin(1∶10 000，Sigma)為內參照。VDS圖像分析系統對結果進行分析，以各對照組表達量為標準，其它組與之相比較。

2.2 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)檢測神經元內與白細胞介素-1受體Ⅰ(interleukin-1 receptor，IL-1RI)結合的PI3K-p85表達的變化 取分組Ⅱ各組細胞總蛋白，每個待測標本取800 μg總量的蛋白提取液，以蛋白體積與IL-1RI抗體體積比50∶1向蛋白標本中加入IL-1RI抗體(1∶50，Abcam)，及瓊脂糖珠，4 ℃ 搖床平搖過夜；孵育完畢，瓊脂糖珠經洗滌后備用；將沉淀的瓊脂糖珠加入上樣緩沖液后，11 000 r/min 高速離心1 min，沸水浴5 min使蛋白變性，隨后馬上于冰上靜置。此后按Western blotting的流程將標本上樣、電泳、轉膜、孵育抗體和顯影。

2.3 FM4-64染色觀察神經元突觸胞吞情況 干預完畢的細胞，加入灌洗液及FM4-64(6.7 μmol/L)靜置5 min后，棄染液，予灌洗液持續灌洗10 min后，對細胞進行觀察。在圖像記錄期間保持細胞接收1 mL/min灌洗液的持續灌注。在相同放大倍數的顯微鏡視野下，盡量選擇包含同樣數量細胞胞體的圖像觀察。被FM4-64標記的直徑在0.1～0.6 μm之間并且熒光強度高于平均背景水平3個標準誤的亮點被記錄，選擇10個區域進行計數分析。所用軟件為Image-Pro Plus 5.1，放大倍數為400倍。

3 統計學處理

所有實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示。多樣本均數比較采用單因素方差分析，兩樣本均數比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。全部資料用Excel 7.0和SPSS 13.0軟件處理。

結 果

1 shRNA干擾PI3K-p85以及rapamycin對IL-1β所致神經元內PI3K-p85、p-Akt和p-p70S6K水平的影響

IL-1β能明顯增加神經元內PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K和MAP2的水平，與對照組比較，有統計學差異(P<0.05)；運用慢病毒轉染技術將shRNA干擾PI3K-p85后，IL-1β所致PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K和MAP2的蛋白水平表達增加均受抑制，與IL-1β組比較有顯著差異(P<0.05)；rapamycin能抑制IL-1β所致PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6K和MAP2表達增加，與IL-1β組比較有顯著差異(P<0.05)；慢病毒轉染抑制PI3K-p85和rapamycin同時作用，能增強對IL-1β的抑制作用(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The protein levels of PI3K-p85, p-Akt， p-p70S6K and MAP2 in the neurons. *P<0.05 vs control group; △P<0.05 vs IL-1β group; □P<0.05 vs IL-1β+PI3K(-)+Rapa group.

2 shRNA干擾PI3K-p85以及rapamycin對IL-1β所致神經元形態的影響

對照組神經元發育成熟，突起交叉成網明顯，胞體豐滿光滑；IL-1β刺激可以使神經元胞體聚集，突觸增粗變長、分支增多，突觸之間的接觸增多；而慢病毒轉染至PI3K-p85抑制以及rapamycin預處理細胞可以抑制IL-1β所致的神經元突觸生長，并且以兩者共同作用的抑制效果最明顯，見圖2。

Figure 2.The morphological change of the nuerons after intervention observed under light microscope (×250). A: control group; B: IL-1β group; C: IL-1β+PI3K(-) group; D: IL-1β+Rapa group; E: IL-1β+PI3K(-)+Rapa group.

3 shRNA干擾PI3K-p85以及rapamycin對IL-1β所致神經元胞吞的影響

經FM4-64染色后，未經處理的對照組可觀察到神經元突觸部位有少量的胞吞小泡形成；IL-1β干預神經元后，在神經元的突觸部位胞吞小泡數量明顯增加；而PI3K-p85抑制以及rapamycin預處理都能減少IL-1β所致的神經元的突觸部位胞吞小泡數量明顯增加，且以兩者共同作用的抑制效果最明顯，見圖3。

Figure 3.The endocytosis of the neurons (×400).

4 PP2抑制后IL-1β對神經元p-Akt、p-P70S6K及MAP2的影響

利用PP2阻斷IL-1RI與PI3K-p85的結合后，IL-1β所致的神經元內p-Akt、p-p70S6K及MAP2的蛋白水平增加情況受抑制，與IL-1β組比較有統計學差異(P<0.05)，見圖4。

討 論

MTLE屬于癥狀性癲癇的范疇，其特點是在初次損傷和慢性自發發作之間有一個無驚厥發作的無癥狀期。我們此前的研究已證實，炎癥反應促進MTLE的發生發展，并且IL-1β起著關鍵作用[2]。

mTOR是一種存在于哺乳動物細胞中非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， p70S6k和蛋白質翻譯起始因子eIF4E結合蛋白l(eIF4E binding protein 1，4EBP1)是其最直接的下游底物[9]。通過磷酸酸化p70S6k與4EBP1，mTOR調控細胞的存活、生長、增殖、分化、黏附、移行、自我更新和細胞周期等，被認為是調節細胞存活、生長、增殖和分化的中心樞紐[10]。最新研究表明，mTOR信號通路與癲癇發生密切相關，從遺傳性癲癇到各種原因引起的獲得性癲癇，mTOR信號通路均被證實存在過度激活[11-12]。Rapamycin是mTOR特異性的抑制劑[13]。有研究報道，rapamycin還能減少癇性發作的次數，并且能阻止或逆轉導致癲癇發生的病理改變，達到“抗癲癇發生”的作用。本部分研究中，我們利用IL-1β刺激體外培養的原代神經元發現，神經元內p70S6k的磷酸化水平明顯增高，MAP2表達增加，神經元突觸胞吞作用增強，提示IL-1β能激活mTOR，進而活化神經元。

PI3K/Akt是公認的細胞內經典的重要信號途徑，參與分化、增殖、凋亡以及NF-κB的激活、糖原合成、糖酵解、葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節[14]。對PI3K/Akt/mTOR途徑的整體認識始于上世紀九十年代，當PI3K及Akt被活化，mTOR隨之被激活，通過調節其下游的p70S6k和4EBP1管理基因編碼及蛋白合成。目前在多種腫瘤如小細胞肺癌[15]、胃癌[16]、T細胞性急性淋巴細胞白血病[17]、宮頸及子宮內膜癌等的發生過程中，都觀察到該途徑相關蛋白編碼基因突變及異常活化。近年，關于PI3K/Akt/mTOR途徑活化與神經系統疾病的相關性受到關注，Lee等[18]報道PI3K/Akt/mTOR途徑活化與半側巨腦綜合癥發病有關。創傷后癲癇模型中mTOR活化依賴于PI3K/Akt信號途徑[19]。在本部分實驗中，我們觀察到，利用IL-1β刺激體外培養的海馬神經元，發現神經元內PI3K-p85、p-Akt、p70S6k和MAP2的蛋白水平增加，神經元胞吞作用明顯增強，說明IL-1β激活mTOR、活化神經元的同時，伴隨有PI3K及Akt的活化。而同時抑制PI3K-p85和mTOR，或者單獨抑制PI3K-p85，可阻斷IL-1β所致的前述變化；單獨抑制mTOR不能抑制IL-1β所致的PI3K-p85活化，由此可推斷，IL-1β通過PI3K/Akt/mTOR途徑促進了海馬神經元的活化。

進一步對IL-1β與PI3K-p85之間的信號傳導方式的研究發現，利用酪氨酸激酶家族抑制劑PP2阻斷PI3K的p85亞基與IL-1R1的結合，神經元內Akt、p70S6K和MAP2的水平不因IL-1β刺激而增加，神經元胞吞作用也減弱。Davis等[20]也報道，IL-1β刺激下丘腦神經元時能活化Akt，且這種活化依賴于PI3K的亞基p85向膜上IL-1R1的募集。這說明IL-1β通過IL-1RI作用于PI3K的p85亞基，進而激活PI3K/Akt/mTOR途徑，通過mTOR下游的p70S6k磷酸化，最終活化神經元。這一結果對闡明炎癥與癲癇發生的相關性有重要意義。

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IL-1β stimulated neuron activationviaPI3K/Akt/mTOR pathway

GAN Na1, 2, YIN Fei2, PENG Jing2, WU Li-wen2, HE Fang2, CHEN Chen2

(1DepartmentofClinicalMedicine,GuangxiMedicalCollege,Nanning530021,China;2DepartmentofPediatrics,Xiang-yaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China.E-mail:yf2323@hotmail.com)

AIM: To study the effect of interleukin-1β (IL-1β) on neuron activation during the process of medial temporal lobe epilepsy (MTLE).METHODS: IL-1β, rapamycin [an inhibitor of mammalian target of rapamycin (mTOR)]and lentiviral transfection to knockdownPI3K-p85 were used to pre-treat the neurons. The protein levels of PI3K-p85, p-Akt, p-p70S6K and MAP2 were detected and the relationship among the tested cytokines was analyzed. The neuron endocytosis was observed in each group. RESULTS: IL-1β increased the protein levels of PI3K-p85, p-Akt and p-p70S6K, up-regulated the expression of PI3K-p85 binding with IL-1RI in the neurons, and increased the neuron endocytosis compared with control group (P<0.05) . These processes were inhibited by rapamycin and silence of PI3K-p85 (P<0.05). Inhibition of the PI3K-p85 binding to IL-1RI decreased the protein levels of p-Akt, p-p70S6K and MAP2 which were increased by IL-1β stimulation (P<0.05). CONCLUSION: IL-1β activates PI3K-p85 by binding with IL-1RI to promote the activation and proliferation of neuron synapses via PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, which might be one of the mechanisms in MTLE chronic progress.

Interleukin-1β； Mammalian target of rapamycin； Medial temporal lobe epilepsy; Neuron activation

1000- 4718(2015)03- 0397- 06

2014- 09- 05

2014- 11- 24

國家自然科學基金資助項目(No.81171226；No.81100846)；湖南省博士后科研資助專項計劃(No. 2014RS4007)

△通訊作者 Tel: 0731-84327208; E-mail： yf2323@hotmail.com

R741.02

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.003