三種去除非全長cDNA片段方法的比較研究

田 飛，李翠新，何 德

（西南林業大學，云南 昆明650224）

1 引言

在構建全長cDNA文庫時，連接和轉化是關鍵步驟。在做樣品與載體連接之前，去除由PCR擴增不完全和限制性內切酶酶切產生的非全長cDNA片段是必不可少的工作，殘留的非全長cDNA片段會直接影響連接效果，影響建成文庫的代表性、冗余度和挑取單克隆測序的工作量[1～3]。而SMART技術中去除非全長cDNA片段的方法也由其創立的CLONTECH公司從2001年的膠回收法[4]，改為 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法，而在近幾年又改為CHROMA－SPIN 400柱離心法。然而多年來廣大的科研工作者大多數只是對其提供的去除方法進行延用，卻沒有見到對這3種方法進行平行比較和取舍的研究報道[5，6]。本文作者通過實驗發現最新的CHROMA－SPIN 400柱離心法的純化效果并不理想，所以對這3種方法做了一個綜合比較，以期得到最經濟有效的純化方法，為后繼實驗者提供指導和參考。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料

小桐子花采自云南省昭通市巧家縣。瓊脂糖購自BIOWEST公司，膠回收試劑盒購自OMEGA公司，CHROMA－SPIN 400柱購自CLONTECH公司，PCR儀購自 BIORAD公司，型號為 C1000TM Thermal cycler，槍頭和離心管購自美國Labnet公司，其他試劑均為國產分析純。

2.2 擴增并酶切cDNA

將反轉錄得到的cDNA用PCR儀擴增后，取160μL擴增液，用SfiⅠ限制性內切酶酶切處理，備用。具體操作參照 CLONTECH 公司的 CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit說明書。

2.3 膠回收法純化

取50μL酶切過的PCR擴增液跑瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒做膠回收，膠回收液標記為1號處理液，－20℃冰箱中保存備用。

2.4 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法純化

取20個滅菌處理過的2mL離心管，編號1到20。從冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室溫放置1h活化，顛倒數次后垂直放置于一支架上，讓管中的樹脂重新沉降成柱。30min后，待樹脂柱上表面清晰可見，掰斷舍棄尾，揭開頂蓋，排出柱中緩沖液，再往柱中添加TE緩沖液沖洗依次，待尾管處停止滴液后，給尾管套上白尾套。取50μL酶切過的PCR擴增液，小心加到樹脂上表面的中心位置。待樣品液完全被樹脂柱吸收后，打開尾管，用移液槍往柱中滴加TE緩沖液沖洗，并立刻用標記好的離心管依次放于尾管下承接洗脫液，每管接一滴，直至接滿20管。立即做瓊脂糖凝膠電泳檢測，合并最早出現條帶的前三管洗脫液，標記為2號處理液，－20℃冰箱中保存備用。

2.5 CHROMA－SPIN 400柱離心法純化

從冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室溫放置1h活化，顛倒數次后垂直放置于一支架上，讓管中的樹脂重新沉降成柱。沉降完全后，掰斷舍棄尾，并迅速套上一個配套的收集管，揭開頂蓋，700g，離心5min。將收集管連同管中的收集液一起丟掉，拿一個新的配套收集管給純化柱套上，取50μL酶切過的PCR擴增液，小心加到樹脂柱上表面的中心位置，700g室溫離心5min，純化好的cDNA樣品即在新的收集管中。取出純化柱，給收集管蓋上蓋子，標記為3號處理液體，－20℃冰箱中保存備用。

2.6 濃縮純化液體至等體積

為控制變量，將3份純化液濃縮至等體積。具體方法為往3份純化液中各添加1／10倍體積3mol／L的NaAc，1.3μL濃度為20μg／μL的糖原溶液和2.5倍體積－20℃預冷的95%乙醇，搖晃混勻后置于－20℃冰箱中冷凍1h助沉。1h后取出離心管，14000g室溫離心20min。用槍頭小心吸去上清，再添加100μL80%的乙醇震蕩洗滌一次。14000g低溫離心后，吸去乙醇層，酒精燈旁晾干沉淀，再均以7μL RNase－free水溶解沉淀。

3 結果與分析

3.1 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法電泳檢測結果

CHROMA－SPIN 400柱重力自流法的20管洗脫液，每管取3μL，用瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖1所示，含有樣品的洗脫液出現在15、16、17、18四管中，而且這四管洗脫液的條帶在500bp處都有一細窄的亮帶，是由急劇的cDNA含量減少造成的，說明CHROMA－SPIN 400柱重力自流法讓樣品液中小于500bp的cDNA片段的量有了明顯的減少。

圖1 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法洗脫液檢測電泳圖

3.2 三份處理液濃縮至等體積后電泳檢測結果

取1、2、3號濃縮液和未處理的酶切過的RT－PCR擴增液各3μL做瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2。

圖2 三種方法純化液濃縮至等體積后電泳圖

3種方法的處理液電泳檢測都有條帶，CHROMA－SPIN 400柱離心法的條帶與膠回收法的條帶亮度接近，說明這兩種方法回收率接近，都較低，且都顯著低于CHROMA－SPIN 400柱重力自流法的回收率。而從圖4中可以較明確的看到經CHROMA－SPIN 400柱重力自流法和CHROMA－SPIN 400柱離心法處理過的樣品液電泳圖在低于500bp范圍內仍然有彌散帶出現，而膠回收法在500bp以下處幾乎沒有暗帶了，說明膠回收法除去小分子cDNA片段較徹底，而另兩種方法雖然使500以下cDNA片段有明顯減少，但去除并不徹底。

3.3 綜合對比三種方法

結合以上檢測結果，從成本、實驗用時、去除效果、回收率和一次處理溶液量對3種方法進行綜合比較，如表1所示。

表1 三種方法綜合比較表

4 結語

從綜合對照表和電泳對比圖中我們可以看到最新的CHROMA－SPIN 400柱離心法除了操作較簡單，實驗較快捷之外，在小分子去除效果上與CHROMASPIN 400柱重力自流法相比并沒有優勢，而且關鍵的回收率遠不及CHROMA－SPIN 400柱重力自流法。而膠回收法實驗用時最少，而且小分子片段去除較徹底，只是回收率較低。所以綜合來看，當樣品量較多時適宜采用膠回收法，不僅小分子片段去除較徹底，成本最低，而且可一次處理大量樣品，省時；當樣品量較少時，適宜采取CHROMA－SPIN 400柱重力自流法保證回收率，雖然費時一點；反倒是最新的CHROMASPIN 400柱離心法在關鍵的回收率和小分子去除效果兩方面與另兩種方法對比，都處于劣勢，所以不可取。

筆者分析認為CHROMA－SPIN 400柱離心法與CHROMA－SPIN 400柱重力自流法相比，回收率之所以低很多，是因為離心力使大孔樹脂之間聚集太緊密，阻礙了cDNA片段的通過，而重力自流法中的大孔樹脂聚集只受重力，不受離心力，所以聚集程度適中，大分子cDNA片段剛好能通過，而小分子cDNA則被大孔樹脂吸附。而膠回收法之所以回收率較低，主要是因為有大量核酸樣品殘留在瓊脂糖中，未被選擇性溶出，隨離心廢液一起丟棄了。改變點樣量，膠回收中殘留洗脫不下來的損失樣品量基本不變，所以一次點樣越多，損失量不變，回收率就相對提高，可以用這種方法來相對提高膠回收率。另外，最近報道有凍融法、透析袋電洗脫法和低溶點瓊脂糖[7]等新的膠回收方法能夠顯著提高膠回收率，相信這些方法能夠彌補膠回收法回收率低這一缺點，而且膠回收法具有要去除的片段大小可以通過肉眼直觀，選擇切出，選擇范圍自由的優點。

所以從長遠來看，最有潛力成去除全長cDNA溶液中非全長cDNA片段的最佳方法的是膠回收法。

[1]龍松華，陳信波，鄧 欣，等.SMART技術構建亞麻韌皮部全長cDNA文庫[J].中國麻業科學，2008，30（3）：128～130.

[2]張 震，王教瑜，杜新法，等.稻曲病菌cDNA文庫的構建[J].植物病理學報，2008，38（5）：462～467.

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[5]陳華，姜寶杰，張 沖，等.花生果皮全長cDNA文庫的構建及初步分析[J].福建農林大學學報：自然科學版，2013，42（1）：57～62.

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[7]胡 靜，溫進坤.三種從瓊脂糖凝膠回收DNA片段方法的比較[J].中華醫學遺傳學雜志，1994，11（4）：238.