PEG－6000脅迫對枳殼種子萌發生理特性的影響

吳云忠，楊雪蓮，孫嘉怡

（貴州大學，貴州 貴陽550025）

1 引言

我國柑橘種植面積和總產量均居世界首位，柑橘產業已成為我國南方主產區農村經濟的一大支柱產業［1］。由于我國南方栽培柑橘，出現灌溉不均一，偶遇自然災害（旱、澇）導致柑橘減產，因此，篩選或培育抗旱性強，優質的柑橘砧木資源尤為重要。

聚乙二醇－6000（PEG）用于模擬土壤干旱來研究植物水份虧缺具有較高的實踐價值［2］。PEG－6000不易自由通過植物細胞壁，不易滲入活細胞內，不會給植物內增加營養物質，無毒，但能使活細胞緩慢吸水等優點，而常被作為干旱脅迫的滲透脅迫劑［3］，已在蘋果、香蕉、棗、櫻桃、葡萄、柑橘等果樹上廣泛應用［4～8］。李志剛等人的研究蘆筍在PEG模擬干旱條件下的生理生化變化［9］試驗結果表明PEG可有效提高作物抗性功能表達。本試驗以綠衣枳殼、旺蒼大葉枳為試材，研究柑橘種子在不同濃度梯度PEG模擬干旱脅迫下萌發過程中生理特性的動態變化，為柑橘抗旱性鑒定和抗旱種質的篩選和利用提供理論依據。

2 材料與方法

2.1 供試材料

以綠衣枳殼、旺蒼大葉枳種子為供試材料。綠衣枳殼采種地點為貴陽市花溪區；旺蒼大葉枳種子來源于重慶農科院柑橘研究所，采種時間為2013年10月，試驗時間為2014年2～4月。

2.2 試驗處理方法

選擇成熟、飽滿且大小一致的種子，經0.50%的次氯酸鈉消毒5min，蒸餾水沖洗干凈，滅菌濾紙吸干種子表面水分后，均勻擺放在鋪有2層濾紙的90mm玻璃培養皿中，每皿30粒種子，分別加入6mL不同水勢的PEG－6000溶液，依據 Burlyn［10］等的PEG－6000溶液配制公式，配成0%（為對照ck）、12.5%、17.6%、21.1%的PEG－6000溶液，模擬干旱條件進行處理。綠衣枳殼的0%、12.5%、17.6%、21.1%處理分別命名為 A1、A2、A3和 A4；旺蒼大葉枳的0%、12.5%、17.6%、21.1%處理分別命名為 B1、B2、B3和 B4；于25℃恒溫培養箱內進行恒溫培養，每處理設3個重復。播種后0d、5d、10d、15d進行相關生理生化指標的測定。

2.3 指標測定及方法

α－淀粉酶、SOD、POD、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白檢測分別采用3，5－二硝基水楊酸比色法、氮藍四唑（NBT）法、愈創木酚法、硫代巴比妥酸法、蒽酮比色法和考馬斯亮藍染色法，具體見雄慶娥編寫的植物生理學實驗教程［11］一書。

3 結果與分析

3.1 SOD酶活性的動態變化

SOD是植物體內重要的抗氧化保護酶，它直接影響著活性氧的清除，而細胞對活性氧的清除能力越強，則可避免植物體內過度積累的活性氧對細胞膜和細胞功能的傷害，因此細胞大量產生SOD說明抗性越敏感。兩種枳殼種子隨著脅迫時間的延長，SOD酶活性出現明顯的上升趨勢，隨著脅迫濃度的提高，SOD酶活性呈現不同程度提高的趨勢。在15d檢測結果顯示不同濃度脅迫枳殼的SOD酶活性變化最大，且綠衣枳殼的SOD酶活性比旺蒼大葉枳呈現顯著性差異，具體見圖1。種子在萌發過程中SOD酶活性也呈現增長趨勢，可見SOD酶也隨著種子萌發而產生變化。

3.2 POD酶活性的動態變化

由圖2可知，隨著脅迫時間的延長，POD酶活性呈現逐漸增加的趨勢，且兩個品種間差異不大。隨著PEG脅迫的逐漸增強，種子內部產生了過氧化物酶POD，以清除PEG脅迫中出現的活性氧，從而提高了種子的抗脅迫能力，低濃度短時間的脅迫更有利于POD酶活性的提高。整體比較旺蒼大葉枳產生的POD少于綠衣枳殼。

3.3 MDA含量的動態變化

植物脂質過氧化物的產物丙二醛（MDA）是檢測植物細胞傷害的一個重要指標，它的含量高低反映植物細胞膜的傷害程度［12］。從圖3可看出，兩個枳殼種子隨著PEG脅迫時間的加深，MDA含量基本保持直線增加趨勢。而綠衣枳殼在同一時間、同一脅迫濃度下MDA的含量基本上小于旺蒼大葉枳。對照結果表明，隨著種子萌發時間的延伸，MDA含量也呈現逐漸增加的現象，說明MDA參與種子萌發的代謝過程。

3.4 可溶性蛋白含量的動態變化

植物體內的可溶性蛋白質大多是參與各種代謝的酶類，在受到干旱脅迫時會發生變化，測定其含量變化是了解植物抗逆性的一種重要方法［13］。由圖4可知，可溶性蛋白在一定時期內并沒有隨著PEG濃度的增加而增加，兩個品種0～10d均在一定范圍內波動，且兩個品種0～5d均呈現下降趨勢，脅迫至10d回升至初始狀態，檢測至15d時各個處理可溶性蛋白含量均有明顯增高趨勢。干旱脅迫抑制蛋白質的合成并誘導蛋白質的降解，從而使植株體內的總蛋白質含量降低［14］。本研究0～5d結果表明綠衣枳殼與旺蒼大葉枳的可溶性蛋白含量下降，與前人研究結果一致。在第5～15d上升的原因可能是在PEG脅迫下，激發了某種特殊的蛋白表達，此現象有待于今后進一步研究。對照結果表明，隨著種子萌發時間的延伸，可溶性蛋白基本上沒有變化，推論可溶性蛋白較溫和參與種子萌發過程。

3.5 α－淀粉酶活性的動態變化

α－淀粉酶是主要的淀粉水解酶，其活性的高低是影響種子萌發的關鍵因素，在種子萌發時，α－淀粉酶以水作為介質，把種胚中的淀粉分解轉化為可溶性糖，若α－淀粉酶不能發揮分解和轉化淀粉的作用，種子的萌發則受到抑制。由圖5可見，隨著PEG脅迫時間的加長，兩個枳殼種子的α－淀粉酶的活性呈先上升后下降的趨勢，在0～5dα－淀粉酶含量增加迅速，5～10d呈現緩慢增長趨勢，10～15d下降且下降趨勢較為明顯。綠衣枳殼的α－淀粉酶活性低于同一時間、同一脅迫濃度下的旺蒼大葉枳。對照α－淀粉酶活性變化保持相對穩定，說明在PEG脅迫下α－淀粉酶發揮作用抑制種子萌發。

3.6 可溶性糖含量的動態變化

可溶性糖是植物體內重要的滲透調節物質，在逆境中其含量會顯著增加以調節組織的滲透壓，從而提高植物的抗旱能力。圖6顯示隨著PEG脅迫時間的加長，可溶性糖的含量呈上升趨勢，對照組的可溶性糖基本上沒有變化。綠衣枳殼的可溶性糖含量隨時間延伸呈現逐漸升高的趨勢，隨PEG濃度的升高呈現升高再降低的趨勢，可見干旱脅迫也抑制可溶性糖的產生。旺蒼大葉枳的可溶性糖含量變化與綠衣枳殼相似，只是品種差異導致同一時期同一濃度旺蒼大葉枳的可溶性糖含量低于綠衣枳殼，與α－淀粉酶活性的變化趨勢正好相反，即綠衣枳殼的α－淀粉酶活性低于旺蒼大葉枳。

4 結論與討論

PEG模擬干旱脅迫將引起植物一系列的生理特性的變化。本研究表明PEG脅迫對兩種枳殼種子保護酶系統、MDA含量、滲透調節物和α－淀粉酶含量都有一定程度的影響。

在正常條件下，植物體內的保護酶和自由基處于平衡狀態，但當遭遇逆境時，植物體內會產生過量的自由基和活性氧，對植物細胞造成傷害，但植物會動員保護酶如POD、SOD來清除超出植物本身能夠承受的自由基，避免它對細胞膜的傷害，所以保護性酶在保持植物正常發育的過程中起到關鍵作用。前人研究結果顯示保護性酶與植物的抗氧化能力成正比，是評價植物抗逆性的重要標志。本研究中，兩個枳殼的SOD、POD變化趨勢相似，均隨著脅迫濃度和時間的延伸，SOD、POD活性呈明顯上升的趨勢，干旱脅迫處理的酶活性高于對照，且輕度和中度脅迫與對照相比結果更為顯著。

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化降解的產物之一，它與蛋白質氨基酸殘基反應生成的產物會降低細胞膜的穩定性，導致膜的滲漏，增大了細胞膜的選擇透性，使電解質外滲，葉綠體膜、線粒體膜等亞細胞器膜的功能、結構等破壞，導致生理功能的紊亂，MDA含量的增加會加重細胞膜的傷害。本研究表明，綠衣枳殼的MDA含量在同一時間、同一脅迫濃度下小于旺蒼大葉枳?？购盗姷姆N的細胞膜透性和外滲量小于抗旱力弱的種，所以MDA含量高的樹種抗旱力弱，可初步推斷綠衣枳殼的抗旱力強。

植物在干旱脅迫條件下會積累滲透調節物質，有效地提高植物滲透調節能力 以增強植物的抗旱性［15］。滲透調節物質包括無機離子和有機物質，其中有機物質有可溶性蛋白、可溶性糖等。可溶性糖含量的增加有利于增強植物的抗旱性，本研究中，隨著PEG脅迫時間的延長和脅迫強度的增加，可溶性糖含量逐漸上升，其中以中度脅迫最為敏感，綠衣枳殼的可溶性糖含量始終大于旺蒼大葉枳。本研究表明，隨著脅迫時間的延長，枳殼種子中的α－淀粉酶活性先增加后減少，在脅迫開始，α－淀粉酶活性增加以提高種子的抗旱力，表現了植物自身的應激反應，但隨著PEG脅迫時間的延長，種子失水情況逐漸嚴重，而α－淀粉酶在行使其功能時又以水為介質，隨著種子含水量的下降α－淀粉酶活性也下降。綠衣枳殼的α－淀粉酶活性始終高于旺蒼大葉枳，這表明綠衣枳殼的抗旱性更強，這與保護酶系統、MDA含量、滲透調節物的研究所得的結論相同。綠衣枳殼的可溶性糖含量高于旺蒼大葉枳，而α－淀粉酶活性低于旺蒼大葉枳，這個現象有待今后進一步深入研究。

［1］馬 杰，劉 涓，魏朝富.三峽庫區柑橘園種植田塊立地條件及其改造工程設計［J］.西南大學學報：自然科學版，2013，5（3）：124～132.

［2］龔子端，李高陽.PEG干旱脅迫對植物的影響［J］.河南林業科技，2006，26（3）：21～23.

［3］梁國玲，周青平，顏紅波.聚乙二醇對羊茅屬4種植物種子萌發特性的影響研究［J］.草業科學，2007，24（6）：50～53.

［4］Molassiotis AN，Sotiropoulos T，Tanou G，Kofidis G，Diamantidis G，Therios E.Antioxidant and anatomical responses in shoot culture of the apple rootstock MM 106treated with NaCl，KCl，mannitol or sorbitol［J］.Biologia Plantarum，2006，50（1）：61～68.

［5］趙軍營，李韶華，代占武，等.半根和全根干旱對嘎拉蘋果組培苗滲透調節物質積累的影響［J］.西北植物學報，2005，25（12）：2 484～2 489.

［6］Celikkol AU，Ercan O，Kavas M，Yildiz L，Yilmaz C，Oktem HA，Yucel M.Drought－induced oxidative damage and antioxidant responses in peanut（Arachis hypogaea L.）seedlings［J］.Plant Growth Regulation，2010，61（1）：21～28.

［7］劉世鵬，劉濟明，陳宗禮，等.模擬干旱脅迫對棗樹幼苗的抗氧化系統和滲透壓調節的影響 ［J］.西北植物學報，2006（9）：1 781～1 787.

［8］Tian Zhiguo，Wang Fei，Zhang Wene，et al.Antioxidant mechanism and lipid peroxidation patterns in leaves and petals of marigold in response to drought stress［J］.Hort.Environ.Biotechnol，2012，53（3）：183～192.

［9］李志剛，劉 威，林彰文，等.蘆筍在PEG模擬干旱條件下的生理生化變化［J］.生態科學，2006，25（1）：21～24.

［10］Burlyn EM，Kaufmann MR.The osmotic potential of polyethylene glycol 6000［J］.Plant Physiology，1973，51：914～916.

［11］雄慶娥.植物生理學實驗教程［M］.成都：四川科學技術出版社，2003：46～87.

［12］鄒 琦.植物生理學實驗指導［M］.北京：中國農業出版社，2004：166～174.

［13］史玉煒，王燕凌，李文兵.水分脅迫對剛毛檉柳可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量變化的影響［J］.新疆農業大學學報，2007，30（2）：5～8.

［14］魏良民.對幾種旱生植物的碳水化合物和蛋白質的研究［J］.干旱區研究，1991（4）：38～41.

［15］周 玲，王乃江，張麗楠.PEG脅迫對文冠果種子萌發和幼苗生理特性的影響［J］.西北植物學報，2012，32（11）：2 293～2 298.