CRISPR/Cas9系統在水稻基因編輯中的應用研究進展

陳偉潘

摘 要 CRISPR/Cas9系統是新一代的基因定點編輯技術，已成功應用于多種物種，例如，人、鼠、果蠅等。簡單介紹該技術在水稻中的研究進展。 涉及該系統的啟動子、轉化方法、突變效率等內容。

關鍵詞 CRISPR/Cas9；水稻；基因編輯

中圖分類號：S511 文獻標志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）03--02

基因的準確、便捷、高效率的編輯技術一直是生物分子領域有待解決的難題。2013年，在《SCIENCES》上發表的2篇有關clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated 9（Cas9）系統進行人和鼠基因的定點編輯技術[1-2]，宣告該定點突變技術獲得了重大的突破。CRISPR/Cas9系統是繼轉錄激活樣效應因子核酸酶（TALEN）技術和鋅指核酸酶（ZFN）之后的新一代的基因定點編輯技術，CRISPR/Cas9系統可準確對基因進行插入或者缺失，從而定點的敲除目標基因。自該系統首次在人類和鼠中進行基因的定點敲除應用成功以來，該系統也被逐漸應用于其他的物種。例如，果蠅、斑馬魚、線蟲等[3-4]。本文主要介紹CRISPR/Cas9在水稻中進行基因的定點突變的研究進展。

1 CRISPR/Cas9原理

最新報道的CRISPR/Cas9系統屬于Ⅱ型系統，該系統包含crRNA（CRISPR RNA）、tracr RNA（trans-activating crRNA）、核酸內切酶Cas9。Cas9在crRNA與tracr RNA的配合引導下與目標序列特異結合，Cas9的兩個結構域HNH和RuvC分別切開雙鏈中的一條單鏈，產生DNA雙鏈斷裂，并啟動細胞修復機制，通過非同源末端連接產生基于定點突變。其中，crRNA與tracr RNA可以融合為一個引導RNA（sgRNAs）進行使用。其同樣具有和crRNA與tracr RNA配合使用的功能，并且還更方便于載體的構建。

2 CRISPR/Cas9系統在水稻中的應用

水稻作為具有重大經濟意義生物，是我國植物分子生物學研究的重點。2013年Zhengyan Feng 等[5]將Cas9系統成功應用于水稻基因的定點突變，其通過將原核生物的Cas9的密碼子進行偏好性優化，并用35S啟動子驅動Cas9表達，且在Cas9碳端添加核定位信號表達Cas9。使用OsU6-2啟動子驅動sgRNA表達分別構建載體，并用農桿菌介相關導載體轉化水稻愈傷組織。成功對水稻基因SPP，YSA，ROC5準確地進行了突變。這是首次報道了CRISPR/Cas9在水稻基因定點突變中的應用。同期Jin Miao等[6]報道了將Cas9系統成功應用于水稻基因CAO1和LAZY1的定點突變，與Zhengyan Feng等報道的不同的是，其使用Ubi作為Cas9的啟動子，使用U3作為 sgRNA和crRNA：tracrRNA的啟動子，且sgRNA和 Cas9構建在一個載體上共轉化水稻，這系統看起來具有更高效的突變效果，兩個基因的突變率分別達到了83.3%和91.6%。

3 sgRNA的選擇

在水稻的應用中，通過比較發現使用sgRNA要比crRNA和tracrRNA配合使用的效率更高[6]。Huanbin Zhou等[7]發現在水稻中具有85 bp尾巴的sgRNA比48 bp的具有更高的突變效率。另外，研究發現高GC含量的sgRNA具有較高的突變效率，因此，在設計sgRNA的時候，應盡可能選擇85 bp尾巴且高GC含量的sgRNA。

4 多基因、大片段突變

在水稻的應用中，可以通過基于Gateway技術可以構建同時包含兩條或4條sgRNA和Cas9的載體。兩條sgRNA分別用不同的U6啟動子驅動，在水稻原生質體和愈傷組織中成功使染色體出現大片段的缺失，缺失片段可達245 kb ，該系統還可以用于同時一次性突變4個目標基因[7]，多個基因同時突變不會互相影響。

5 CRISPR/Cas9優點

CRISPR/Cas9具有構建載體簡單，特異性高，且可快捷實現多基因甚至大片的敲除，突變位點可以在水稻中穩定地按照孟德爾遺傳定律遺傳，且低脫靶率等優點[8]。必將對水稻的基因功能的研究，以及水稻的育種應用產生深遠的影響，具有廣闊的應用前景。

參考文獻

[1]Le Cong，F. Ann Ran，David Cox，et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR Cas [J]. Systems Science，2013，339（15）：19-822.

[2]Prashant Mali，Luhan Yang，Kevin M Esvelt et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9[J].Science，2013，339（15）：823-825.

[3]Ari E Friedland，Yonatan B Tzur，Kevin M Esvelt，et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system[J]. Nature Methods，2013，10（8），741-743.

[4]Nannan Chang，Changhong Sun，Lu Gao，et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos[J].Cell Reasearch，2013，23（4）：465-472.

[5]Zhengyan Feng，Botao Zhang，Wona Ding，et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J].Cell Rearch，2013，23（10）：1229-1232.

[6]Jin Miao，Dongshu Guo，Jinzhe Zhang，et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas [J].system，2013，23（10）： 1233-1236.

[7]Huanbin Zhou，Bo Liu，Donald P. Weeks，et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice[J].Nucleic Acids Research，2014，42（17）： 1233-1236.

[8]Hui Zhang，Jinshan Zhang，Pengliang Wei，et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J].Plant Biotechnology Journal，2014，12（6）： 797-807.

（責任編輯：趙中正）