陽離子聚合物介導的基因治療細胞內途徑和主要屏障研究進展

Progress research on intracellular pathway and main barriers of cationic polymer－mediated gene therapy

［文獻標志碼］A

［文章編號］1671－587Ⅹ（2015）01－0199－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150139

［收稿日期］2014－03－29

［基金項目］國家自然科學基金資助課題（51201110）

［作者簡介］王茹燕（1987－），女，寧夏回族自治區銀川市人，醫學碩士，主要從事陽離子聚合物介導的基因治療方面的研究。

［通信作者］彭　琳，副教授，碩士研究生導師（Tel：028－85503571，E－mail：gaoendo＠163.com）

選擇合適的基因傳遞載體，使目的基因靶向、可控并有效地表達，是基因治療成功的關鍵。非病毒載體具有合成簡單、可以攜帶大容量的遺傳物質和無免疫原性等優點而愈來愈受到研究者的重視 ［1－2］。其中陽離子聚合物由于具有安全性高，免疫原性低，易于對DNA進行操作，價格低，特別是其結構易于改造等優點，已經被廣泛應用于基因治療研究 ［3－4］。但是較低的轉染效率和瞬時蛋白表達是此類載體應用的最大障礙。因此如何提高陽離子聚合物的基因轉染效率成為目前非病毒基因傳遞體系研究的熱點問題之一 ［5］。治療基因作用的發揮需要克服基因傳遞過程的各種障礙，才能獲得較高的轉染效率 ［6］。因此理解陽離子聚合物傳遞DNA的途徑以及聚合復合物傳遞DNA過程中的主要障礙，有助于合理設計高分子基因傳遞載體，使其化學結構和性質符合基因傳遞過程中的不同要求 ［7］。

1　陽離子聚合物介導的基因傳遞的胞外屏障

聚合復合物在達到靶器官或靶細胞之前必須經歷和克服能夠使復合物轉染效率降低、復合物解離、引起DNA降解或復合物被清除的各種胞外屏障，包括血液循環過程中的屏障、組織中的屏障和其他屏障 ［8－9］。

1.1　血液循環中的屏障　在基因治療靜脈給藥時，聚合復合物首先必須經過血液循環才能達到靶器官或靶細胞。血液中的成分主要引起聚合復合物的聚集和導致DNA提前從復合物中釋放出來，此外血漿中的核酸酶也能引起DNA的降解。這2個方面的作用均能使聚合復合物阻留或者使其轉染能力下降 ［6］。

聚合復合物的穩定性取決于陽離子聚合物的結構和其與DNA的正負電荷的比。已知血漿中的紅細胞、白蛋白和纖維蛋白原等易與聚合復合物發生非特異性結合，使復合物的表面電位降低，減少粒子之間的靜電排斥力，最終導致復合物的聚集。過多的聚集還會引起復合物在血管壁上的沉積，血管組織內包含的高濃度富含陰離子的黏多糖也能結合富含陽離子的聚合復合物。有研究 ［10］發現：小鼠頸動脈壁可結合相對分子質量為84　000的聚賴氨酸（PLL）和聚酰胺胺樹狀物濃度達10g·L －1，且經過4h的動脈灌注也不會被洗脫。聚合復合物的聚集使聚合物不容易分散，降低了聚合物的轉染能力，另一方面這些聚合復合物聚集的結果是容易被巨噬細胞和網狀內皮細胞系統（reticuloendothelial system，RES）迅速清除，因而大大減少了聚合復合物進入靶器官和接觸靶細胞的量。

1.2　組織中的屏障　聚合復合物經靜脈應用后，在血流中可產生成簇的多聚物，并隨血液循環到達全身各主要器官，大部分快速由肺內皮細胞、肝竇中Kupper細胞及脾中的巨噬細胞清除。此外，機體的自然防御機制如補體系統、網狀內皮系統和免疫系統都可清除外來粒子 ［11］。當聚合復合物達到靶器官或靶細胞的周圍組織時，將同細胞外的一些物質發生相互作用，增加的離子強度會削弱載體與DNA之間的相互作用。這些物質包括細胞外基質（如糖蛋白、硫酸軟骨素和膠原等）和黏膜分泌物（如透明質酸和黏蛋白等），具體隨給藥方式不同而異。在細胞外環境中，聚合復合物應該足夠穩定，才能高效運送到靶細胞表面。這就要求陽離子聚合物載體具有較低毒性，避免復合物和細胞外基質中蛋白的相互作用，避免DNA被降解，減少復合物和非靶向器官、組織和細胞的相互作用。細胞外基質指細胞間具有保護靶細胞作用的多聚化蛋白和糖類，在這些物質的存在區域，相對較大的DNA傳遞體系難以逾越 ［12－13］。

1.3　其他屏障　聚合復合物還會面臨一些屏障，包括調理素（opsinnins，如血清抗體、補體等）、吞噬系統和降解酶等。這些屏障在血液循環和組織中都可能存在。其中調理素能與載體及其靶基因結合從而使基因和載體失活，聚合復合物表面多余的陽性電荷在體內能激活補體系統，造成目的基因在未到達效應細胞前被吞噬破壞；吞噬系統則是機體對于異物的非特異性防御系統，存在于機體各部位的單核吞噬細胞（也有中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的參與）對入侵的大分子物質有吞噬、消化和消除的作用，而肝和脾中的網狀內皮系統則既能捕獲、內吞又能消化基因傳遞載體系統；在血液和組織中存在的各種降解酶如血清中和胞周液中的核酸酶能迅速消化未被保護的DNA分子，從而降低達到靶細胞表面的DNA的量。

2　陽離子聚合物介導的基因傳遞的細胞內途徑和胞內屏障

聚合復合物經歷了從注射部位到達靶細胞過程中的一系列障礙，開始轉染靶細胞。陽離子聚合物將質粒DNA從細胞表面傳遞至細胞核內部所遇到的屏障包括細胞膜、內涵體－溶酶體、細胞質、核膜和聚合復合物的解聚。

2.1　細胞內吞（endocytosis）　陽離子聚合復合物必須通過細胞內吞才能進入細胞。聚合復合物的細胞內吞機制有2種 ［8，14］：①非特異性吸附內吞（adsorptive endocytosis）。復合物表面帶正電荷，通過與細胞膜表面帶負電荷的硫酸蛋白多糖發生靜電相互作用而被細胞吸附，從而發生細胞內吞。細胞攝取復合物的主要機制為胞吞機制的激活，當將轉導細胞與細胞內吞抑制劑（如松胞菌素B及去氧葡糖）或細胞代謝抑制劑（如疊氮化鈉）共孵育后，其復合物攝取率及相應轉導基因的表達率均顯著降低 ［15］。②特異性受體介導攝取。細胞膜表面含有很多特定的受體分子，可在陽離子聚合物表面連接上特異性的配體，通過配體與細胞上的受體結合，提高聚合復合物的靶向性，即所謂的受體介導內吞 ［16］。偶聯陽離子聚合物的配體有許多，如半乳糖、甘露糖、葉酸、上皮細胞生長因子、轉鐵蛋白和CD3等。

2.2　內涵體的釋放　聚合復合物經細胞內吞后進入內涵體（endosome），正常情況下大分子或異物被細胞內吞后，與胞膜形成內涵體，內涵體被溶酶體迅速吞噬后二者融合形成內涵體－溶酶體復合物。在內涵體－溶酶體內DNA如果不能被保護，并及時有效地被釋放，則會被溶酶體內的酶降解，因此聚合復合物能否從內涵體－溶酶體中逃逸，是決定轉染成功與否的關鍵之一。

對于結構中含有氨基的陽離子聚合物，聚乙烯亞胺（PEI）和聚酰胺胺樹形分子 ［17］，在其介導的基因傳遞過程中，聚合復合物采用一種被稱為質子海綿陽吸附作用的方式從內涵體－溶酶體中逃逸。這類分子結構中含有氨基的陽離子聚合物可以在溶酶體內的酸性條件下離子化，在pH　5～7時具有極強的緩沖能力，能夠吸附大量的質子H ＋，成為“質子海綿”。這類高緩沖能力的陽離子載體隨著內涵體的酸化而使內部氨基質子化，可作為弱堿基對抗內涵體的酸化作用，因此能夠抑制晚期內涵體的酸化，從而隨著H ＋和C1 －的內流，內涵體發生滲透性膨脹、最終破裂，釋放聚合復合物 ［11］。

2.3　細胞質中的傳遞　聚合復合物從內涵體逸出后，能否在胞質內不被降解，從細胞質移動到核周圍空間也同樣影響著基因的表達和功能。細胞質由微絲和微管的復雜網、高濃度蛋白質和各種亞細胞器組成，是具有高黏度的及尺寸在300～400的篩狀網狀結構，只有小于250個堿基對的DNA分子在細胞質中是自由擴散的，大于54nm的分子的被動擴散會受到細胞質的限制 ［18］。細胞質的各種蛋白、微管和其他細胞器都會阻礙聚合復合物的運動。有絲分裂期間，聚合復合物可以通過胞質的分離而重新在細胞內分配，從而使一些復合物能到達細胞核附近。有證據 ［19］表明：帶有正電荷的納米聚合復合物能夠通過非特異性地與負電性的微管或肌動蛋白作用而沿著細胞骨架網移動到核膜。陽離子聚合物作為DNA從胞質移動到核膜周圍的傳遞介質，可保護DNA免于細胞質內核酸酶的降解，延長DNA在胞質內的存活時間，從而增加DNA入核的機會。

2.4　轉導入核　經過細胞質的傳遞，DNA必須跨越核膜進入細胞核才能發揮其作用。核膜由帶有核孔的雙層膜組成，核孔復合物（nuclear pore complex，NPC）由大約100個不同的蛋白亞單元構成，只允許離子和小分子的自由擴散，直徑小于9nm的分子或相對分子質量小于60　000的蛋白質可被動彌散通過NPC中間水通道。DNA轉導入核的可能途徑包括：①細胞分裂時核膜的破裂，在核膜破裂時，DNA被重新分配并定位在核內。聚合復合物或DNA因此進入細胞核。有研究 ［20］發現：在細胞進行有絲分裂時加入聚合復合物后，轉染效能比細胞周期停止時要高，說明有絲分裂有利于轉染的進行。Brunner等 ［21］的研究發現：在細胞分裂前不久進行的轉染效率比細胞生長初期的轉染效率高30～500倍，認為細胞周期分布是影響陽離子聚合物載體介導的基因轉染的重要因素，有絲分裂（包括S期和G 2期）時的細胞核膜破裂可以提高轉染效率。這也是增殖快的細胞轉染效能比不分裂或者分裂慢的細胞高的原因。②經核孔進入。有研究 ［22］指出：當核孔直徑為80nm時，雖然僅留下9nm的中央水通道，但直徑小于28nm的顆粒仍然可以從核孔中通過，因此粒徑小于28nm的聚合復合物有可能通過核孔進入細胞核。③與核膜融合。一些研究者 ［21］認為：聚合復合物進入到胞核會使復合物與核膜融合，由帶正電荷的復合物與帶負電荷的膜磷脂相互作用所介導。這個過程可能與復合物包裹有一層親脂層有關，親脂層可能來自聚合復合物表面附著的陰離子磷脂分子，或者是內涵體裂解后的殘留片斷，聚合復合物可能是因為親脂層與核膜融合而使復合物進入核內。

2.5　陽離子聚合物／DNA復合物的解聚　在DNA轉錄目的基因翻譯之前，陽離子聚合物／DNA復合物必須發生解聚，才能釋放DNA，DNA的釋放是實現轉錄的首要條件。DNA從聚合復合物中的解聚可能與DNA聚合酶從組蛋白上解離DNA的方式類似，也可能是細胞內的多聚陰離子如DNA和RNA取代了復合物中的質粒從而使DNA從復合物中解離 ［11］。在基因傳遞過程中，聚合復合物過早的解聚會導致DNA的提前降解影響目的基因的傳遞，而較遲的或者是不完全的分解會影響基因的有效表達 ［23］。若載體／DNA復合物的穩定性不同，則DNA的釋放有可能發生在不同階段。聚合復合物的解聚究竟發生于入核之前，還是入核之后尚有爭議。多數研究者 ［24］認為：DNA在入核前從聚合復合物卸載并非必需。有研究 ［25］表明：PEI／DNA復合物基因傳遞過程中，DNA從內涵體中釋放后，仍然是與PEI緊密結合的，DNA進入細胞核時，部分復合物并未發生解離。DNA一旦進入細胞核，轉染效率主要取決于基因表達系統，經轉錄和翻譯，最終產生目的基因編碼的蛋白質。

3　陽離子聚合物的設計與展望

利用陽離子聚合物基因傳遞過程中的特點，研究者們設計了不同結構的新型聚合物，用以避免上述胞內外屏障對其轉染效果的影響。針對不同靶器官，在陽離子聚合物的結構上嫁接特異性受體，增加聚合物靶向定位的能力 ［26－27］。如以半乳糖基團對聚合物進行化學修飾，用以增加聚合物對肝細胞的特異性吸附，增加聚合復合物轉染肝細胞的效率 ［28－29］。針對聚合復合物從內涵體－溶酶體中順利逃逸對轉染過程的重要性這一特點，有研究者在轉染過程中加入抑制溶酶體的藥物（如氯喹），可以提高DNA的轉染效率 ［30］。這是因為氯喹是弱堿，經細胞攝取后能升高內涵體的pH值，從而抑制內涵體－溶酶體之間的融合，有助于復合物從核內體中脫離出來，避免了DNA被核酸酶降解，因而能有效提高轉染的效率 ［30］。為了使聚合物跨越核膜這一屏障，研究者在聚合物的結構中設計了核定位信號（nuclear localization signal，NLS）肽，有利于聚合物跨越核膜。研究 ［22］發現：將單一的NLS肽段與一個報告基因共價結合，可以使基因的表達提高1　000倍。NLS不僅可縮短DNA在胞質中的逗留時間，還可以輔助DNA進入細胞核 ［31］。目前研究最多的NLS是來自SV40的T抗原，其經典氨基酸序列為Pro－Lys－Lys－Lys－Arg－Lys－Val （PKKKRKV），這一序列得到了廣泛應用。Zanta等 ［32］將環形CMV－Luc質粒線性化，然后在兩端加帽，其中一端含有合成的SV40NLS，用這一質粒與PEI混合后轉染細胞，轉染效率顯著提高。

由此可見，充分了解陽離子聚合物基因傳遞的過程以及屏障，對于新型陽離子聚合物的設計具有重要意義。利用陽離子聚合物的結構易于進行化學修飾的優點，可以在其表面修飾以靶向特異性配體或抗體；或在基因傳遞過程中，使用可以促進聚合復合物跨越胞內外屏障的藥物，均有望應用于聚合物的設計之中 ［33－34］。