小腸黏膜下層細胞及內皮細胞平滑肌細胞構建組織工程血管的初步研究*

王 飛，魏紅芳，胡成棟，張恩錄，高愛芹，王 瑞，李東風

(河北省邯鄲市中心醫院：1.骨科；2.麻醉科 056001)

?

·臨床研究·

小腸黏膜下層細胞及內皮細胞平滑肌細胞構建組織工程血管的初步研究*

王 飛1，魏紅芳2，胡成棟1，張恩錄1，高愛芹1，王 瑞1，李東風1

(河北省邯鄲市中心醫院：1.骨科；2.麻醉科 056001)

目的 初步探究小腸黏膜下層(SIS)細胞及內皮細胞、平滑肌細胞構建組織工程血管的實驗方法、條件及可行性。方法 取20只家兔(6～8周大)，于體外分離培養內皮細胞、平滑肌細胞并標記，最后進行組織工程化血管的自體移植。結果 實驗結果表明于培養板中合成的支架材料呈現為白色、均勻質地；內皮細胞及平滑肌細胞可較好附著并植入SIS材料。結論 小腸SIS及內皮細胞、平滑肌細胞構建組織工程血管具有可行性，并具有十分重要的醫學應用價值。

小腸黏膜； 下層細胞； 內皮細胞； 平滑肌細胞

天然血管具備天然成分及結構并具有良好的生物相容性，可以提供細胞需要的各種信號[1]，同時也可以有效促進細胞的黏附和保留分化功能。因此，天然血管是組織工程血管支架的最佳材料。小腸黏膜下層(SIS)是天然細胞外基質類生物衍生材料，通常由豬小腸制備，人工處理后的SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及少量Ⅴ、Ⅵ膠原構成，制備的SIS厚度約80 μm，具有無免疫原性、抗微生物活性、優良的生物力學性能，并能促進組織再生，是組織工程細胞外基質很有前途的生物材料[2-3]。在此基礎上，以異種SIS為細胞外基質預構成三維管道，將內皮細胞與平滑肌細胞在三維管道上聯合培養，復合構建組織工程化血管的設想，在國內外雜志未見相關報道，其可行性值得探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗動物：20只6～8周家兔；主要的試劑：乙二胺四乙酸(EDTA)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)、含氯化鈉(NaCl)的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液、含0.05%疊氮化鈉的PBS溶液、膠原酶、乙酰膽堿、氯化鉀及硝普鈉等；主要的儀器：F12培養基、DMEM培養基、光鏡、掃描電鏡熒光顯微鏡或細胞流式儀等。

1.2 方法

1.2.1 豬小腸黏膜下層的制備與檢測 (1)制備：取健康豬的空腸長約10 cm，沖凈，機械法去除外面的漿膜層與肌層，翻轉后去除黏膜層，縱向切開黏膜下層基質，浸泡于100 mmol/L EDTA與10 mmol/L NaOH(pH 11～12)溶液中，去離子水沖凈；再浸泡于1 mol/L HCl與1 mol/L NaCl溶液中6～8 h，去離子水沖凈，在含1 mol/L NaCl的PBS溶液(pH7.0～7.4)中浸泡16 h，去離子水沖凈，在PBS溶液中浸泡2 h，去離子水沖洗2 h，0.2%過氧乙酸(含5%無水乙醇)消毒30 min，在含0.05%疊氮化鈉的PBS溶液清洗2 h，用2.5×10-5Gy γ射線照射。(2)光化學交聯劑固定處理后，進行光鏡、掃描電鏡及免疫組化檢測，驗證其脫細胞情況。(3)由于SIS黏膜面較漿膜面有更低的孔隙率，因此將SIS黏膜面朝內包繞細玻璃棒上，于顯微鏡下應用9/0無創線縫合出直徑為2 mm、長約20 mm管狀基質，在體外檢測其生物力學性能，包括平均破裂壓、彈性模量及縱向的屈服應力。處理后的管狀脫細胞基質以玻璃化法保存。

1.2.2 豬小腸黏膜下層基質抗原性檢測 將處理后的豬小腸黏膜細胞基質，切取1 cm2植入家兔皮下組織，7 d后取材，于光鏡、免疫組化檢測脫細胞基質在家兔體內的免疫反應情況。如有條件可行單克隆抗體檢測家兔單核淋巴細胞黏附蛋白(CD18)。

1.2.3 內皮細胞與平滑肌細胞分離與培養 (1)無菌條件下取家兔自體大隱靜脈，去污，膠原酶灌流消化，采集內皮細胞進行傳代培養，應用熒光顯微鏡或細胞流式儀進行細胞鑒定；(2)采用類似方法對平滑肌細胞進行分離、培養與鑒定。

1.2.4 內皮細胞與平滑肌細胞種植與擬生態環境下培養 (1) 取傳代培養2～3代的內皮細胞，胰蛋白酶消化、離心漂洗后，種植內皮細胞于1 cm2的豬SIS基質上，培養鑒定內皮細胞能否在此基質上成活。(2)生態環境動態旋轉反應器的制備：血管細胞在生理條件下，受到流體切變應力、管壁舒縮產生的牽張應力以及靜水壓等應力，這些應力環境對于血管細胞的形態、增殖、極性及基質構成與結構有著重要影響。參考相關資料，制備簡便有效、適于血管灌注培養的動態旋轉反應器。(3)內皮細胞與平滑肌細胞種植：取2 cm制備好的直徑為2 mm管狀SIS基質置于反應器內，接種內皮細胞，在37 ℃與5%CO2條件下孵化，動態培養液灌注，第2天應用微型注射器將平滑肌細胞多點隨機注射入管狀脫細胞基質內，繼續動態培養4周。培養期間，定期進行細胞計數器計數、光鏡、電鏡及免疫組化檢測基質內細胞量及活性。

1.2.5 組織工程化血管生物學及生物力學性能檢測 (1)應用乙酰膽堿、氯化鉀、硝普鈉等藥物，比較正常股動脈與工程化血管間生物學方面的差別；(2)檢測正常股動脈與工程化血管平均破裂壓、彈性模量及縱向的屈服應力，比較SIS基質、正常股動脈、工程化血管三者間生物力學方面的差別；(3)通過光鏡、電鏡及免疫組化檢測，比較正常股動脈與工程化血管二者形態學方面的差別。

1.2.6 組織工程化血管的自體移植 (1)管狀SIS基質種植細胞后2周，經鑒定細胞成活后，分別取自體股動脈及管狀SIS基質為對照，行工程化血管移植(均不行全身抗凝藥物治療)，于1、2、4、8周定期取材，應用乙酰膽堿、氯化鉀、硝普鈉等藥物，比較正常股動脈與工程化血管間生物學方面的差別；并行大體、光鏡、電鏡及免疫組化檢測，觀察其血管通暢率、形態學及免疫相容性，以確定其可行性。(2)取管狀SIS基質行血管替代，以自身為對照(均不行全身抗凝藥物治療)，定期取材檢測，在血管通暢率、形態學及免疫相容性等方面，與組織工程血管相比較。

2 結 果

2.1 大體觀察結果 于培養板中合成的支架材料呈現為白色、均勻質地，所合成的組織工程管形支架材料，外徑大小為6 mm，內徑大小4 mm，長度為3 cm左右，且有韌性及彈性。

2.2 接種時細胞形態的觀察結果 貼附于SIS材料上的人體血管內皮細胞和平滑肌細胞經倒置顯微鏡觀察顯示為細胞胞體透亮，呈現為球形并均勻地分布在SIS材料表面。

2.3 免疫組織化學觀察結果 SMA抗染色體觀察的結果顯示：內皮細胞及平滑肌細胞能夠滲透于SIS材料之中，并最終形成數層有規律的細胞結構。

3 討 論

目前全世界每年大約有20萬例周圍血管移植，自體血管移植是迄今最理想的替代物，但由于：(1)自體靜脈血管本身結構上與動脈存在差異；(2)靜脈本身具有較高的病變率；(3)長度與來源合適的自體非必需血管來源有限；(4)以創傷修復創傷的治療模式增加患者痛苦等缺點，而限制其應用[4]。人工合成材料的發展使人工大血管的替代成為現實，但材料生物相容性與血管順應性差、昂貴的價格、抗凝藥物長期應用的不良反應以及小管徑血管通暢率很低等條件，使其仍需不斷改進[5]。組織工程技術在血管方面的應用，以其高度組織相容性、抗凝性、抗感染及可生長性，為血管的替代與重建展示了美好的前景[6-8]。但是在種植細胞的研究、細胞外基質以及病損組織替代等方面仍有諸多問題急需解決。

Matsumoto于1967年首先提出應用SIS作為血管組織補片后，各國學者就開始不斷探索SIS作為血管移植物的研究。相關研究表明：(1)SIS血管較ePTFE有更強的抗感染力，其浸提液能夠抑制多種細菌生長[9]；(2) SIS有比自體血管更強的再生能力，雖然血管順應性無明顯變化，但2個月后SIS移植物壁厚較原來增厚10倍以上，隨著SIS退變與吸收，按照血管生理與力學的要求不斷改造[10]；(3)SIS對于5～8 mm口徑血管進行移植后，生物力學檢測顯示移植物獲得力學重建；(4)以SIS為體外細胞培養底物，對6種細胞進行不同形式的培養，結果顯示聯合三維培養更有利于再現細胞生理特性[11]；(5)SIS在縱軸方向的抗拉強度為肌腱與韌帶的1/7～1/14，并且彈性大，適于作為血管的替代材料等[12]。

綜上所述，SIS及內皮細胞、平滑肌細胞構建組織工程具有可行性，并具有十分重要的醫學應用價值。

[1]Khan Y,Yaszemski MJ,Mikos AG,et al.Tissue engineered periosteum fabricated using bone marrow mesenchymal stem cells and small intestinal submucosa[J].J Tissue Eng Regen Med,2011,15(21):3801-3804.

[2]付煒，薛繼鑫，何曉敏，等．應用血管脫細胞基質膜片構建組織工程血管的初步研究[J/CD]．中華臨床醫師雜志:電子版，2012，6(22)：7090-7094．

[3]孫慶蘭，張華，張西正，等．內皮細胞與小腸黏膜下層細胞相容性的初步研究[J]．天津工業大學學報，2010，29(3)：71-73．

[4]Weissman IL.Construction of Tissue-Engineering of heart valves in vitro[J].Tianjin Yi Yao,2011,39(3):250-252.

[5]楊洪武，韓超，池強，等．不同支架材料構建組織工程肌腱的性能評價[J]．中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(3)：539-542．

[6]李彬，洪浪，尹秋林．組織工程血管支架材料的評價[J]．中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(21)：3883-3886．

[7]符培亮，張雷，吳宇黎，等．小腸黏膜下層與滑膜間充質干細胞的組織相容性[J]．中國組織工程研究，2013，17(47)：8202-8208．

[8]尹鳴鏑，趙正凱，張健．不同材料構建組織工程化血管支架:特點與效應[J]．中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(16)：2958-2962．

[9]王曉白，曹廣劭，張紅，等．小腸黏膜下層覆膜支架促進經頸靜脈肝內門腔靜脈分流道內皮化的有效性[J]．中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(30)：5626-5630．

[10]覃榮周．構建組織工程化半月板:細胞、支架及生物因子[J]．中國組織工程研究，2013，17(20)：3764-3769．

[11]王少云，吳迪，張麗，等．骨髓間充質干細胞復合小腸黏膜下層構建組織工程皮膚修復糖尿病皮膚缺損[J]．中國組織工程研究，2012，16(3)：443-448．

[12]王峰，肖明第，廖斌，等．小腸黏膜下層-骨髓間充質干細胞移植治療陳舊性心肌梗死[J]．中國胸心血管外科臨床雜志，2010，17(4)：344-346．

河北省邯鄲市科技計劃項目(1223108090-3)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.033

A

1672-9455(2015)04-0517-02

2014-06-09

2014-09-16)