蘭科植物離體培養的研究進展

曹劼

（福建省　將樂縣　林業局　353300）

蘭科植物離體培養的研究進展

曹劼

（福建省將樂縣林業局353300）

本文綜述了近幾年來蘭科植物離體培養的研究現狀，分析了目前存在的問題，并對蘭科植物離體培養的前景進行展望。

蘭科植物；離體培養；展望

1　蘭科植物離體培養的研究現狀

以下從蘭科植物離體培養的外植體選取、培養基、植物激素、有機添加劑以及環境條件如溫度、濕度、光照、酸堿度等方面進行綜述：

1.1外植體選取

1.1.1莖尖

莖尖是植物細胞分裂最活躍的部位，也是較容易誘導和培育成功率較高的部位，是最早用于蘭科植物快速繁殖的外植體。春蘭、建蘭、墨蘭等均可用莖尖誘導出大量的類原球莖，然后類原球莖發育成根狀莖后進一步成長為幼苗。研究表明，莖尖作為外植體更適合文心蘭、大花蕙蘭等復軸生長類型的蘭花。李曉青等采用莖尖誘導原球莖的方法對大花蕙蘭“瀑布”進行了初代離體培養，成功地誘導出原球莖并增殖分化出幼苗。

1.1.2種子

蘭科植物的種子細小如粉，數量極多，其微小的種子本身不含胚乳和子葉，只有發育不完全的胚，儲存在胚中的營養成分無法提供種子萌發所需要的有機養分，因而在自然條件下，種子萌發率很低。Link早在1824年就觀察到自然條件下蘭花種子萌發伴隨著真菌感染的現象。1899年Bemard首次分離出蘭花的根菌，并用其感染蘭花的種子進行萌發試驗，從而創立了共生萌發法。研究表明，大部分蘭花種子都可以實現非共生萌發，即不需要任何真菌浸染就完成在人工培養基上萌發。隨后，研究者用非共生萌發也對石斛蘭、文心蘭、蝴蝶蘭等的種子進行萌發研究，取得了成功。之后，非共生萌發逐步代替了共生萌發，成為蘭科植物組織培養的熱點，蘭科植物種子用于組織培養極富有前景。

1.1.3花梗

花梗在單莖性蘭花組織培養中應用較多。以花梗作為蘭花的外植體的最大優點在于獲取原材料容易，消毒滅菌容易，也能保護母株免受更多的傷害，且能獲得與母株優良性狀一致的再生苗，但其也有不足之久，就是取材受到開花季節的限制。近幾年來，關于利用蝴蝶蘭花梗來誘導芽苗或類原球莖的增殖方式的研究較多。魯雪華等的研究發現用蝴蝶蘭花梗節間切段誘導頻率比莖尖、根尖要高得多；李軍等對蝴蝶蘭組織培養的工廠化生產技術研究也是利用蝴蝶蘭的花梗作為外植體的。卜朝陽等以蝴蝶蘭花梗為外植體，誘導腋芽萌發并成功獲得無菌苗。

1.1.4葉片

葉片是較為理想的外植體材料，既可以減少對母株的傷害，取材又不受到花季限制。其中試管苗的幼葉作為外植體進行培養效果最好。Kuo等利用蝴蝶蘭試管苗研究了離體葉片誘導體細胞胚胎發生的過程，并通過類原球莖再生成苗。以試管苗幼葉為外植體經體細胞胚胎發生途徑再生成苗試驗的成功，不僅為蘭科植物優良種苗的快速繁殖提供了有效途徑，也為蘭科植物轉基因研究提供了很好的技術平臺。

1.2培養基

植物培養基作為植物離體培養的核心技術，主要包括碳源、維生素、無機鹽、生長調節劑、有機添加物構成，它供給和保障植物組織離體狀態下良好生長的必要營養。在蘭科植物離體培養中，最常用是MS、KC、VW、N6、White和他們的改良型。不同植物材料生長分化所需的營養條件各不相同，甚至同一植物不同部位的生長分化要求也各不同，因此在選用基本培養基時可根據不同品種和培養階段加以修改。羅吉鳳等比較了MS、1/2MS、1/ 2N6、White等培養基對鐵皮石斛種子萌發的影響，結果發現，30d種子發芽率均達到95％，但是原球莖的直徑存在差異，1/2MS培養基上所萌發的原球莖最大，說明1/2MS更利于種子萌發。江建銘等以金線蓮的莖節段作為外植體，選用了MS、1/2MS、VW、B5和KC等5種培養基進行不定芽誘導，經60d的培養，MS、B5培養基中不定芽增殖率明顯高于其它三種，結果表明MS、B5培養基更適合金線蓮莖段不定芽誘導的基本培養基。

1.3植物激素

植物激素是影響植物離體形態發生的關鍵因素，控制著細胞生長、分化、發育等生理變化和形態形成，對誘導蘭花原球莖、新植株體形成和蘭花品種種子發芽至關重要。目前常使用的植物激素主要是IAA、NAA和2，4-D等生長素類和KT、ZT和BA等細胞分裂素類，適當濃度的生長素和細胞分裂素對愈傷組織的形成和芽的分化有促進作用。對不同的蘭科植物來說，在不同的生長發育階段所需激素的量及種類都不盡相同。在金線蓮壯苗培養中，NAA對促進幼苗生長的影響比6-BA更為明顯。鄭亞琴[31]研究了植物激素對大花蕙蘭繁殖系數的影響，發現繁殖系數不僅取決于激素的濃度，還取決于激素之間的比例，當NAA0.2mg/L、BA0.8-1.2mg/L時，大花蕙蘭繁殖系數較高。

1.4有機添加物

有機添加物由于含有許多復雜、有效的成分而廣泛應用于蘭科植物的離體培養。離體培養中常用的有機添加物有椰子汁、香蕉、土豆和馬鈴薯等。李蕤等在研究香蕉泥、蘋果汁、椰子汁3種添加物對霍山石斛幼芽生長影響的實驗中發現，這3種添加物都能促進幼芽的生長，其中香蕉泥的效果最為明顯。實驗進一步研究了香蕉泥的添加量對幼芽生長的影響，結果表明香蕉泥對幼芽的誘導表現出添加量的臨界點，超過臨界量后不利于霍山石斛幼芽的生長。何松林等比較了蛋白胨、胰蛋白胨、蘋果汁、番茄汁、椰子汁對文心蘭原球莖增殖的影響，結果表明蛋白胨對文心蘭原球莖的增殖效果最為顯著，而胰蛋白胨、蘋果汁和椰子汁對文心蘭的幼苗分化影響較大。

1.5環境條件

光照強度對外植體的生長有一定的影響。蘭花在接種初期根據不同種類大多維持黑暗或200～600lx的弱光，到類原球莖階段后給予1000～2000lx的強度，長根壯苗階段以2000～3000lx為好。大花蕙蘭、金線蓮等關于光照的研究都證明了這一點。Gow等的研究發現，光照時間越長，外植體褐變率越大，體細胞胚胎的發生率越低。培養基的pH值直接影響到培養物對離子的吸收，過酸或過堿都對植物材料生長有影響。蘭花所用的培養基一般呈弱酸性，pH值在5.0～6.0，不同的種類對pH值的要求不同。蝴蝶蘭原球莖在pH值5.0～5.4的環境中生長最好，叢生芽的誘導和增殖在pH值為5.6～5.8時較好。在pH值5.2～5.8范圍內，霍山石斛有較高的出芽率，尤其是pH值為5.8時。

2　蘭科植物離體培養過程中存在的問題

2.1污染的發生

污染主要有細菌性污染和真菌性污染兩類，細菌性污染的表征為菌斑呈粘液狀物，在接種1～2d即可發現，造成的原因一般由于材料帶菌、培養基滅菌不徹底、操作人員的不當等。真菌性污染是指培養基表面貨材料表面出現菌絲，繼而很快形成不同顏色的霉菌，接種3～10d后才發現，多為周圍環境的不清潔、培養用具的口徑過大、超凈工作臺的過濾裝置失效等造成。在蘭科植物離體培養過程中，控制污染是關鍵，尤其在高溫高濕的夏季污染相當高，可能會影響當季的生產計劃，甚至造成品種的丟失。因此在離體培養過程中，盡量將有菌的物體經處理轉化為無菌的物體，這是離體培養的關鍵所在。可以從外植體處理、培養基的滅菌、接種操作、接種室及培養室消毒等方面進行污染的控制。

2.2玻璃化現象

玻璃化是植物離體培養過程中的一種生理失調或生理病變，導致玻璃化苗的產生。在蘭科植物離體培養中，玻璃化現象表現為原球莖透明，含水量高、分化能力降低，試管苗出現莖節多、根多、葉片厚而脆、組織畸形、生長緩慢、移栽成活率低等問題。朱晉云等對大花蕙蘭離體培養兩年多的研究工作證實了這一點。鄧小果等在文心蘭的組織培養過程中也發現了玻璃化現象。植物試管苗玻璃化是組培過程中的三大難題之一，給科研和生產造成極大損失。因此，在實際生產過程中必需采取降低蘭科植物試管苗的玻璃化現象，直至消除玻璃化現象。

2.3褐化現象

克服外植體褐化的措施主要從這幾個方面入手。但是對于不同的蘭科植物材料，降低和防止褐化現象的具體方法有所不同。在對秦嶺野生春蘭組織培養過程中的褐化控制研究中發現，以1/2MS為基本培養基，加入活性炭1g/L，PVP5g/L，pH5.4，在外植體接種初期暗培養10d對減輕外植體褐化最為有效。為減少石斛蘭的褐化現象，陳亞鴻等采取了提高培養基的pH值，添加活性炭以及胰蛋白胨等措施，取得了不錯的成果。尤海波等對解決蝴蝶蘭外植體褐化問題的研究表明，采用帶腋芽的、抽4節的花梗為外植體，用表面活性劑（Tweens20）20×10-6處理10min、70％酒精浸泡30s、0.5％的次氯酸鈉溶液浸泡5min的方法消毒外植體減輕褐化的效果最佳；培養基中添加10mg/LAA和1000mg/L PVP抗褐化效果較好，在誘導階段采用低濃度蔗糖誘導可減少褐化現象的發生。

2.4遺傳變異

植物離體培養的重要目的在于保存種質資源，避免基因的丟失和毀滅，快速繁殖具有價值的花卉苗木。大多數蘭科植物是珍稀瀕危植物，具有很高的觀賞價值、藥用價值和科研價值，如果培養過程中遺傳變異率太高，不僅不能為保存資源和培育優良的品種提供基礎保障，還會嚴重影響到工廠化生產。蘭科植物的遺傳變異是一個非常復雜的問題，引起遺傳變異的因素相當多，主要是植株體的基因型、培養環境以及繼代次數。因此，在蘭科植物離體培養過程中，應盡量選擇遺傳穩定性好的基因型；協調好培養基中的營養元素；選用適合的激素種類和濃度，減少或不使用易引起誘變的物質；控制好培養溫度、濕度和光照；減少繼代次數以降低遺傳變異現象的發生率。

2.5成本高

蘭科植物離體培養過程，不僅繼代增殖次數多，而且周期長，消耗了大量的人力、物力和原材料，生產成本相對較高。成本直接影響商品的競爭力，所以只有降低成本，離體培養才有生命力。因此，在離體培養過程中應在保證苗的質量的情況下盡量降低成本。在培養基方面，可用低成本物質代替一些高成本的物質，比如用白砂糖代替蔗糖等。同時，減少培養過程中的損失，如玻璃化現象、污染、褐化現象等，都可以有效降低成本。另外多查閱相關文獻，參考前人的經驗，可以少走彎路，減少資源的浪費。

3　展望

目前，蘭科植物的離體培養技術已經取得較大進展，但仍有很多技術急需改進和發展。如試管苗移栽后生長緩慢和開花遲的瓶頸研究，可采用人工改造生長環境的方法研究光照強度、溫濕度、栽培基質等長生因子對國蘭生長發育的影響；可以提取藥用成分為研究目的，通過優化培養基成分和生長條件，以提高次生代謝物的含量，尋找最優的培養條件，由離體培養組織到直接生產藥用活性成分；可借助于其它栽培繁育手段結合離體培養技術進行多方位育種，研究如何提高離體培養苗的移栽成活率；同時也可將離體培養技術與物理誘導、化學誘導、基因轉化等技術結合相融合，為培育符合大眾審美觀的蘭花新品種奠定理論和技術基礎。特別是野生珍稀蘭科植物要重點保護，禁止濫采，這樣才能保證蘭科植物種質資源的可持續發展。

S682.31

A

1673-0038（2015）27-0251-02

2015-6-10