轉基因煙草的研究進展

陳永濤，金吉林，張興無，李興忠，羅 會

（貴州省果樹科學研究所，貴州 貴陽 550006）

煙草在整個生育過程中遭受多種病害及蟲害的危害，使其產量與品質受到嚴重影響，造成了巨大的經濟損失［1］。目前防治煙草病蟲害的方法主要是種植抗病蟲品種和藥劑防治蚜蟲。由于農藥在煙草上會有殘留以及會對環境產生污染，所以選育和種植抗性品種在綜合防治煙草病蟲害方面就成為最經濟有效的方法［2］。隨著植物基因工程技術的發展，將來源于動植物和微生物等的抗病蟲基因導入植物以獲得抗病蟲植株，進行作物抗病蟲品種的培育逐漸成為植物病蟲害防治的發展趨勢之一［3-4］。應用轉基因技術將介導病毒抗性的基因導入煙草，獲得抗病毒病及抗蟲的轉基因煙草，能夠有效抵御煙草病蟲害危害。我們對近30 a來基因工程技術在煙草中的應用進行綜述。

1 抗病毒病轉基因煙草

近年來，利用基因工程防治煙草病毒病的主要策略，包括導入衣殼蛋白基因、利用病毒的復制酶基因、利用反義RNA、衛星RNA、植物編碼的抗病毒基因及移動蛋白等［5］。

1990年，Golemboski等將TMV U1株系的一段核酸序列轉入煙草，結果轉基因植株在用TMV U1株系病毒粒子或病毒RNA接種時都表現出高度抗性［6］。1994年，Carr和Gal-on認為轉基因植物表達的復制酶蛋白在病毒的侵染過程中作為一種調節蛋白發揮其正常功能，從而打破了病毒正鏈和負鏈復制的平衡，或是干擾了控制復制酶活性的反饋抑制途徑［7］。1994年，劉玉樂等將普通煙草G140和表達黃瓜花葉病毒（CMV）的衛星RNA的轉基因煙草Sat-G140進行抗煙草花葉病毒（TMV）的侵染試驗，結果表明轉基因煙草Sat-G140表現的感染TMV的癥狀較輕，說明衛星RNA可減弱 TMV引起的癥狀［8］。1995年，Lomonossoft等認為，在RNA水平上，是轉錄出的mRNA與病毒的復制酶進行了無效結合從而抑制病毒復制酶的正常功能，或是mRNA誘導了植物的自然抗病性等［9］。1999年，張振臣等發現，將黃瓜花葉病毒FNY-CMV株系的RNA3 CDNA克隆，構建運動蛋白（MP）基因，再用土壤農桿菌根癌農桿菌（LBA 4404）介導將該基因轉入煙草NC89，經抗性鑒定發現轉基因煙草對CMV有一定的抗性［10］。2001年，黃曉躁等將番茄花葉病毒移動蛋白基因轉入煙草中，并用卡那霉素篩選獲得了一系列的抗性苗，活性測試證明25%的抗性苗有較好的抗番茄花葉病毒的特性［11］。2002年，唐嘉義等報道，將番茄斑萎病毒（TSWV）的外殼蛋白基因轉入煙草后，就獲得了抗TSWV的轉基因煙草，同時發現該轉基因煙草對TMV也有一定的抗性［12］。2003年，郭興啟等報道，通過LBA 4404介導的方法將非翻譯的馬鈴薯YN病毒（PVYN）PVYNCP基因轉入煙草NC89后，獲得了高度抗PVYN的轉基因植株。并初步證明，對PVYN的侵染也具有高度抗病性［13］。2005年，張凱等將TMV的部分運動蛋白基因（駐MP）構建成反向重復結構，插入植物表達載體pBin438上，通過三親交配法導入根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EH105后，應用農桿菌介導法轉化煙草品種云煙87，獲得了50株轉基因煙草。用TMV對轉基因煙草進行挑戰接種，癥狀觀察和病毒濃度的TAS-ELISA檢測表明，轉基因煙草對TMV的抗性包括3種類型：免疫型占10%，抗病型占4%，感病型占86%［14］。2007年，孟凡宏等將水稻黃單胞細菌白葉枯致病變種（Xanthomonas oryzae v.oryzae）編碼的HarpinX100的hrfA基因及其N-末端缺失突變基因AB分別連接到雙元載體pBI121上，構建成轉基因載體i，并經凍融法轉化土壤桿菌EHA105，采用葉盤法轉化煙草，用卡那霉素抗性篩選再生植株。通過PCR擴增檢測了轉化煙草中的靶基因序列即35S啟動子序列，對T1代PCR陽性植株進行了PCR-Southern雜交和RT-PCR分析。結果顯示，外源基因已整合到轉基因煙草基因組中，并在轉錄水平正常表達。用從轉hrfA基因和AB片段的煙草中提取可溶性蛋白注射煙草都能引起過敏反應，說明目的基因在轉基因煙草中能表達出有活性的蛋白?？共⌒澡b定結果表明，轉N-末端AB片段的煙草和轉hrfA全長基因的煙草一樣表現出對TMV的抗性［15］。2008年，李黎等將來自粟酒裂殖酵母的pac1基因導入原核表達載體pET-5a中，并轉入大腸桿菌 BL21（DE3）pLysS，經IPTG誘導，其表達產物能夠降解4種植物病毒CMV、TMV、Rice black-streaked dwarf（RBSDV）、Rice dwarf virus（RDV）和3種類病毒Apple scar skin viroid（ASSVd）、Coleus blumei vi原roid（CBVd）和 Hopstunt viroid（HSVd）的 dsRNA。將pac1導入雙元載體pBI121，并轉入根癌農桿菌LBA4404，以煙草（品種NC89）組培苗的葉片為受體材料進行轉化，經過誘導愈傷、分化、再生和篩選培養，獲得了50株Kana抗性植株，收獲T1種子分別播種，對這些轉基因植株進行PCR、PCR-Southern和RT-PCR檢測，結果表明pac1基因已整合到受體基因組中［16］。同年，朱常香等分別以馬鈴薯Y病毒（PVY）、TMV和CMV全長衣殼蛋白（CP）基因為模板，通過設計PCR引物和亞克隆獲得PVY CP 3'端長度100 bp、TMV CP 3'端長度100 bp和CMV CP 3'端長度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因，并以此為模板構建反向重復結構嵌合基因的植物表達載體pRHPTC。將pRHPTC通過凍融法導入農桿菌LBA4404，采用葉盤法轉化煙草NC89。通過該方法可獲得抗多種植物病毒的轉基因煙草［17］。2010年，宋莉等通過農桿菌介導法將35S驅動的干擾素基因ChIFN-琢轉化煙草，Southern雜交和Western雜交進行目的基因的轉化、表達檢測，重組蛋白的數量通過ELISA測定，對獲得的轉基因煙草植株進行TMV接種試驗，結果表明ChIFN-琢基因的轉化賦予了轉基因煙草對TMV的抗性，進一步的熒光定量PCR差異表達檢測結果表明，該抗性可能與轉基因煙草體內防衛基因PR-la、抗病N基因和信號轉導MAPK基因受到上調表達有關［18］。2013年，江彤等為了獲得抗PVY轉基因煙草，分別擴增PVY HC-Pro基因3'端正、反向片段，構建反向重復植物表達載體，利用農桿菌介導法轉化普通煙草品種云煙85，經抗性篩選及抗病性鑒定，獲得T0代轉基因抗病煙草株系。繁殖T0代抗病株系，抗病性鑒定發現，部分抗病株系的T1代煙株發生了一定比例的抗感分離。Real-time PCR檢測發生抗感分離的T1代煙株發現，抗病煙株中PVY HCPro基因RNA積累水平顯著低于感病煙株，說明抗病煙株中HC-Pro基因發生了RNA沉默。利用dsRNA技術沉默HC-Pro基因，獲得了煙草品種云煙85的T1代轉基因抗PVY株系［19］。同年，孫書娥等應用RNA沉默防治病毒病原理構建中國番茄黃化曲葉病毒（TYLCCNV）外殼蛋白部分基因片段dsRNA（double-strand RNA）導入本氏煙（Nicotiana benthamiana）獲得了抗TYLCCNV的轉基因煙草，結果表明，目的基因已整合到轉基因煙草植株的基因組中［20］。

2 抗蟲轉基因煙草

2.1 利用蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因

提高煙草抗蟲性的第一種策略是利用蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因，Bt-toxin基因是目前世界上應用最為廣泛的抗蟲基因，其表達產物可與昆蟲中腸道刷狀緣表皮細胞表面的特異受體結合，干擾鉀ATP酶活性，造成離子滲漏，破壞細胞的滲透平衡，進而引起細胞腫脹和裂解，并最終導致昆蟲死亡。

1987年，Vaeck等獲得了世界上首例轉Bt基因的工程植株。方法是使用全長的和3'缺失的Cryla（b）基因，在甘露堿合成酶基因啟動子的下游轉化煙草，試驗證明在3'端有缺失的Cryla（b）殺蟲基因的轉基因煙草具有一定的抗蟲性［21］。1991年，田穎川等利用定點突變改造蘇云金桿菌（Bacil原lus thuringiensis）HD-1的δ-內毒素基因 5'端，酶切對3'端進行缺失后，在大腸桿菌中仍能表達出有殺蟲活性的被修飾的毒蛋白。將上述加工過的基因插入到雙元載體pBin437（pBin19的派生質粒）中，借助輔助Ti質粒pAL4404轉入煙草，獲得了抗卡那霉素的再生植株。經Southern印跡和狹槽印跡（Slot blot）雜交證明有1～5個拷貝的毒素基因整合至煙草染色體中。Nolthern印跡法分析結果表明，這2類基因都在轉基因植株中得到表達，有4株5.3 kb類型，3株6.6 kb類型的轉基因植株對煙青蟲有高抗性，與對照相比，這7株轉基因煙草植株的殺蟲率可達40%～50%，并能顯著抑制昆蟲蛻皮和生長發育，表現明顯的抗蟲作用。結果表明，這2類毒蛋白基因都可在植物中表達并賦于轉基因植株以抗蟲性［22］。

2003年，謝龍旭等構建了含草甘膦抗性突變基因（aroAM12）和人工合成重組Bt抗蟲基因（Bts1m）的植物表達載體 pcM12-slm。Northern blot、Immunodot blot分析進一步證明整合的2個基因在轉錄、翻譯水平上均進行了表達，不同植株之間表達存在著差異。草甘膦抗性和蟲試試驗證明，獲得的轉基因煙草對草甘膦和煙青蟲具有很強的抗性［23］。2012年，高川等從蘇云金芽胞桿菌中克隆到的2個殺蟲基因Cry2Ab4和vip3Aall，分別構建了pCS2Ab和pCScip3A植物表達載體，利用農桿菌介導法轉化煙草品種NC89，并得到32株和35株陽性轉基因植株。通過對其進行RTPCR分析、Western雜交分子檢測證實2種外源基因在煙草植株中可正常表達。人工飼喂初齡小地老虎幼蟲，對2種轉基因植株進行生物活性檢測，結果顯示飼喂轉基因葉片的小地老虎幼蟲死亡率在82%以上，抗蟲能力比對照顯著提高［24］。

2.2 利用蛋白酶抑制基因組

另一種抗蟲轉基因煙草的獲得的方法是利用蛋白酶抑制基因組。蛋白酶抑制劑（Proteinasein-hibitor，PI）是一類存在于某些植物中的蛋白質，可與昆蟲消化道內的蛋白消化酶相互作用，形成酶-抑制劑復合物（EI），由此抑制蛋白消化酶的活性。此外，蛋白酶抑制劑還可進入昆蟲淋巴系統，干擾昆蟲免疫功能和蛻皮過程。

1987年，Hilder用土壤農桿菌的Ti質粒介導，將花椰菜葉病毒CaMv 35S啟動子與豇豆胰蛋白酶抑制基因組裝后轉化煙草，轉基因煙草植株具有較強的抗蟲特性［25］。2010年，宋洪元等將置于2個同向lox位點之間的Bar基因表達盒與大豆胰蛋白酶抑制劑SKTI基因表達盒融合后獲得相應植物表達載體，轉化煙草Wisconsin 38后獲得對棉鈴蟲具有明顯抗性的SKTI轉基因植株。此外，作物育種專家還利用其他抗蟲基因及轉雙價抗蟲基因，獲得了具有較好抗蟲性的煙草［26］。2012年，齊洪華等根據已克隆的CABYV P0蛋白基因序列，設計帶酶切位點的特異性引物，PCR擴增用于構建RNAi表達載體的P0蛋白基因正反義片段。將正反義片段分別插入含有內含子的中間載體pBSint上，得到重組的中間載體pBSint-P0-F-R。用Sal I和Sac I雙酶切pBSint-P0-F-R，將切下的包括內含子和正反義P0蛋白基因在內的片段定向克隆到植物表達載體pCambial 300上，得到含有發卡結構的RNAi表達載體pCambia-P0-F-R。通過農桿菌介導的方法將該表達載體轉化本生煙，經PCR檢測，得到4株陽性轉基因植株［27］。

3 展望

雖然煙草抗病蟲轉基因技術的發展已有20多年的歷史，但轉基因技術仍有許多不足。目前，人們對轉基因植物的安全性存在疑慮，并且轉基因技術本身還存在一些缺陷，主要表現在轉基因沉默，基因漂移，轉基因抗病植株抗性的喪失以及抗病性轉基因的生態威脅方面，但任何事物都有兩面性，隨著生物技術的發展，轉基因技術將會在植物抗病育種中得到很好的應用。

通過20多年的研究，煙草抗病蟲轉基因技術取得了較大的進展，特別是近年來發展了一些新的介導抗病性方法。但仍存在許多缺陷，如基因沉默現象使轉入抗病基因的植株抗病性不能正常表達；PTGS效應對整個生物體的影響不明確，對不同的作用靶位，其效應存在差異，通過PTGS途徑獲得的抗病性在植物內是否可以遺傳目前仍不清楚。另外，一些介導病毒抗性的方法對導入基因的作用機制及其與植物體互作方面的研究沒有確定的理論，并且在實際應用中未取得太大的進展。以后的研究工作中，應對各種介導病毒抗病性的機制和作用機理以及互做體系進行更準確、深入的研究，以便從根本上解決問題，進而促進抗病毒轉基因煙草更快、更有效的發展。

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