2014版ICSH體液細胞自動計數儀性能和驗證指南介紹

胡曉波，姚怡婷，王青，熊立凡

(1.上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院，上海201900; 2.上海交通大學醫學院附屬同仁醫院，上海200050;3.上海市臨床檢驗中心，上海200126; 4.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200001)

2014版ICSH體液細胞自動計數儀性能和驗證指南介紹

胡曉波1，姚怡婷2，王青3，熊立凡4

(1.上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院，上海201900; 2.上海交通大學醫學院附屬同仁醫院，上海200050;3.上海市臨床檢驗中心，上海200126; 4.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院，上海200001)

編者按:實驗室所面臨的諸多難題之一是如何驗證自動血液分析儀計數體液細胞的性能。與手工法相比，儀器法提高了計數的準確度、精密度和效率。在加拿大、美國、英國和日本的實驗室展開了一項實踐調查，以確定使用儀器計數體液細胞的實驗室數量和儀器計數的性能指標。根據調查結果，國際血液學標準化委員會(ICSH)成立了體液細胞自動計數儀性能和驗證國際工作組。為了提供自動體液細胞計數準確可靠的結果，工作組制定了一套有助于實驗室規劃和實施自動細胞計數儀驗證的指南，經ICSH大會討論并通過國際專家組審核后，進一步形成了共識。

介紹了2014年國際血液學標準化委員會(ICSH)關于體液細胞自動計數儀的性能評價指南。指南中就實驗室對儀器的正確度、精密度、相關性、攜帶污染、檢出限和分析測量范圍等方面的性能驗證提出了具體的方法和要求，尤其是明確規定了實驗室對采用的各類體液標本均應做性能驗證。

自動細胞計數;體液;腦脊液;驗證

“2014版國際血液學標準化委員會(International Committee for Standardization in Hematology，ICSH)體液細胞自動計數儀性能和驗證指南”的預期目的是建議自動細胞計數儀準確計數體液細胞的驗證方法[1]。目前，市場上有多種類型儀器適用于體液細胞自動計數。因手工體液細胞計數需強勞力、重復性差，且需較高專業水平，許多實驗室已采用自動計數方法，或開始驗證其測量系統。雖然發表了很多驗證的文章，但多數內容并不完整。少數文章研究了制造商未提供的細胞計數性能特征。因此，實驗室有責任對儀器進行完整的確認，而不只是限于驗證。為此，ICSH成立了體液細胞自動計數儀性能和驗證國際工作組(簡稱工作組)。為了讓自動體液細胞計數儀提供、準確、可靠的結果，工作組制定了一套有助于實驗室計劃和實施自動細胞計數儀驗證的指南。

一、實驗室體液檢驗現狀

為了評價實驗室體液檢驗的現狀，由加拿大質量管理能力驗證－實驗室服務(Quality Management Proficiency－Laboratory Services，QMP－LS)機構制定調查問卷，分發到參加加拿大QMP－LS、美國病理學家學會(College of American Pathologists，CAP)、英國血液室間質量評價[United Kingdom that participate in the National External Quality Assessment Service for General Hematology，UKNEQAS(H)]的實驗室以及參加日本實驗血液學學會(Japanese Society of Laboratory Hematology，JSLH)性能驗證計劃的實驗室。

調查問卷的目的是確定實驗室是否使用自動儀器計數腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和其他體液的細胞以及如何確定這些儀器的性能特征。實驗室需說明儀器的性能特征，以確定儀器是否符合體液細胞計數的質量要求。各國對儀器性能進行評估的實驗室比例有很大差異，見圖1。與精密度和正確性相比，對靈敏度、特異度和可報告范圍進行評估的實驗室較少。北美地區驗證這些儀器性能的實驗室比例高于英國和日本。

調查問卷中還詢問了實驗室采用何種程序來保證結果的質量。這些程序包括實驗室是否做體液質控標本、檢測標本前是否做背景計數以及對假性檢測結果有無處理的程序。調查結果見圖2。須注意的是，僅有少數實驗室使用獨立的體液細胞計數質控品。

市場上多數新型的血液分析儀具有體液檢測模式，因此，實驗室應驗證制造商聲稱的每一類型體液的檢測性能特征，包括CSF、漿膜液(心包腔、胸腔、腹腔)和滑膜液。由于低值細胞計數常見于各種體液，尤其是CSF，因此必須驗證儀器準確計數低值細胞的性能。

二、自動系統的確認/驗證

實驗室應了解“確認”和“驗證”之間的區別。“確認”通常由制造商實施，并提供儀器的性能特征。如制造商未對儀器進行確認，則必須由實驗室進行確認。實驗室進行確認時應遵循地區性有關實驗室自建試驗(laboratory－developed testing，LDT)的指南和建議。

驗證是對制造商已確認的儀器進行證實，并提供置于指定檢測地點的儀器能滿足特定性能的證據。在儀器用于檢測前，必須由使用實驗室實施驗證。用于檢測臨床標本的每臺儀器均須進行驗證或進行轉移驗證(見下述)。本指南的建議即用于驗證制造商的聲明。

(一)制造商預期用途

制造商須聲明儀器的預期用途，表明已確認儀器的體液細胞計數的類型。每類體液細胞計數的分析測量范圍(analytical measurement range，AMR)均由供應商提供。實驗室的責任就是關注這些聲明。若實驗室要檢測制造商聲明中未包含的其他體液，則須確認儀器計數這些體液的性能。此試驗即為LDT。表1列出的是最常用于體液計數的血液分析儀，包括了制造商確認的體液類型和參數。

(二)標本處理－分析前變異

實驗室應注意標本采集過程的分析前變異，包括影響可報告結果的容器類型、標本運送和儲存。每個實驗室須有標準操作規程，此規程應遵循所在地區建議的指南。

(三)樣品穩定性

很多文獻報道標本采集后數小時內就會發生細胞退化、溶解和細菌生長。是否會發生這種情況取決于檢測所用時間、貯存條件和標本類型。因此，應在標本穩定的時間內檢測標本，而兩種方法之間的相關性比較則應在2 h內完成。

(四)性能指標

提供儀器有能力報告可靠結果的證據是規范實驗室的做法，在有些國家這已列入相關法規中。與外周血相比，體液有不同于全血的基質，所含細胞種類也不同。因此，確保實驗室對準備分析的每種體液類型的結果具有真實性和可靠性很重要。外周血標本不能用于確認或驗證。許多儀器有專用的體液模式，因此，對全血細胞計數(complete blood count，CBC)的驗證不能滿足體液細胞計數報告的要求。每個實驗室應確定自己的體液細胞計數模式的可接受性。

如實驗室有多臺儀器，或是醫療大集團整體健康網絡的一部分，可對其中一個地點的一臺儀器進行完整驗證，其他儀器則可進行轉移驗證;若儀器均來自同一制造商且型號相同，也只需對一臺儀器進行完整驗證，對其他儀器進行轉移驗證即可。但當其他地點開展實驗室認可時，須提供可用的完整的驗證數據。完整驗證和轉移驗證應做的研究項目見表2。只要標本在運送過程中能保證完整性，就可在不同地點之間共享標本。

1.正確性正確性可用兩種不同的方法進行驗證。(1)可使用分割標本進行比對試驗，通常至少有40例均勻覆蓋可報告范圍的患者標本，結果與實驗室定義的限值進行比較，以判斷差異有無統計學意義;若以手工計數為比較方法，則難度較大; (2)可使用定值的參考物質，如商品化質控品的預期回收值，實驗室應設定可接受范圍的限值。

2.精密度(可重復性)必須對儀器的精密度進行評價，其方式是盡可能的對所有可能影響儀器的變異因素進行評價。用于精密度評價的測試標本應與臨床標本具有相同的特性。建議檢測2個或多個濃度的標本，通常采用1個高濃度和1個低濃度，包括一個任意的醫學決定水平的標本。建議所有標本應至少測定10次，以確定批內精密度。如測定10次有困難時應視可用的標本量而定，但為了能有效統計，至少應檢測5次。還應測定一段時間的再現性(reproducibility)。因患者標本不穩定，故不可能在不同的日期測定同一標本，但可用體液質控品代替。

3.相關性相關性評價應按實驗室可接受的程序和制造商建議的方法來處理和檢測標本，可用實驗室當前使用的、制造商聲稱的方法或參考方法進行研究。應注意的是，在大多數情況下，由制造商提供的用于確認的方法是基于手工計數法。建議至少檢測40例標本，且應覆蓋AMR，特別是醫學決定水平。每一類型體液應做相關性確認。要確定AMR限值的偏倚，體液計數標本須有高值和低值，這對小型實驗室來說可能有一定難度，但標本數越多，相關性越好，且對抗系列濃度干擾物的機會就越大。如參考方法是手工計數法，則建議對同一標本計數2次，以提高手工計數的精密度。應考慮標本的穩定性，為了避免標本儲存成為可變因素，標本應在相同條件下儲存，并在2 h內檢測完畢。

4.攜帶污染要確保高濃度標本不會對隨后檢測的標本造成正偏倚，從而導致結果假性增高，這對CSF標本尤為重要。建議在檢測體液標本前先做空白測試。要確保在分析體液標本前吸入非血液的液體不會引起體液標本的稀釋，從而造成假陰性結果。應先檢測高值標本，隨后測定低值標本。高值標本應測定3次，記為A1、A2和A3，隨后測定低值標本3次，記為B1、B2和B3。用下列公式計算攜帶污染:攜帶污染(%)=×100。有些實驗室在分析體液標本前先檢測空白標本，要確保此做法不會因預稀釋而造成結果假性減低。如按實驗室的可接受性標準，當攜帶污染不可接受時，應要求儀器進行維修或保養，然后再重復進行攜帶污染研究。

5.檢測下限(lower limits of detection，LLD) LLD是最關鍵的驗證步驟之一，尤其是CSF細胞計數。制造商須規定總有核細胞計數和紅細胞計數的下限，且此下限不應低于制造商建議的限值。實驗室計劃分析的所有體液類型均應做LLD的驗證，以證明標本的基質效應。驗證時無須使用不同批號的試劑。了解各種低濃度的不同限值之間的關系很重要:(1)空白限(limit of blank，LOB):是多個空白標本經重復測量，所獲得的空白標本最高測量值;(2)檢出限(limit of detection， LOD)或分析靈敏度:是標本中能檢出的分析物的最低測量值，一般通過重復檢測至少4～6個低濃度細胞計數的標本而獲得，標本濃度通常在LOB到4倍LOB范圍內;(3)定量限(limit of quantitation，LOQ):是在可接受的精密度和正確度下，可檢出的標本分析物最低測量值，須符合實驗室對準確度或總允許誤差的要求。各限值之間的關系是LOB＜LOD≤LOQ。LOD和LOQ常為相同的值，但必須高于LOB。那么如何驗證制造商聲明的LOB和LOD?(1)LOB的測定:如可能，應重復測定一種類型以上、不含任何細胞的體液。建議使用體液標本，以避免基質效應，如無法使用體液標本，則可用稀釋液代替。每個標本應至少重復檢測10次。考慮到實驗室環境不同，此項研究至少應進行2～3 d。由于此類標本難以獲取，所以可根據標本獲取的時間來決定評估的天數。如制造商有特定的LOB，而重復測定的結果中最少有3次≤制造商LOB，則可接受制造商聲明的LOB。(2)LOD的測定:如制造商有特定的LOD，則采用等同于制造商聲稱的低濃度標本和相同的程序;如95%的結果一致，則可使用制造商聲稱的LOD;否則，實驗室須建立自己的LOD。(3)LOQ的測定:無論觀察到的LOD精密度是否符合實驗室設定的可接受精密度目標，均需做LOQ;可采用與檢測LOD相同的方法測定LOQ。LOD或LOQ是能可靠檢測的最低細胞計數值，故符合實驗室不確定度即偏倚和不精密度的目標。

6.分析特異性(包括干擾因素)制造商應確定任何可能會導致結果錯誤的干擾物。體液中的干擾物可以是小凝塊、結晶等任何物質，實驗室應查出這些干擾物對結果的影響。研究應預先確定考慮實驗室的特定患者群體，應涵蓋各種體液類型，包括有干擾物的體液和來自各種疾病狀態患者的體液。此項研究可納入患者的相關性研究。

7.AMR和線性AMR是指細胞計數的范圍，是儀器能準確測量未經任何預處理(如稀釋)的標本的能力。應使用和體液基質相似的標本進行相關研究。建議實驗室對儀器預期要檢測的每一類型體液均做線性研究。制造商必須確定AMR，實驗室有責任驗證這些聲明。線性可通過檢測制造商聲明的線性范圍內的5～7個濃度予以證明，每個濃度應重復測定3次。試驗中應使用制造商建議的稀釋液。重要的是，線性驗證濃度須包含醫學決定值、最高濃度和檢測下限值的細胞計數濃度，尤其是CSF標本。在驗證期間可能很難收集到高濃度的標本。因此，可在日后收集到高值標本時再復做線性驗證，并更新實驗室方案，以反映更高的檢測上限。

(五)標本數量限制

大多數實驗室進行驗證或確認研究時，面臨的最大障礙可能是標本的可利用性。一旦決定做自動體液計數，就應將數據收集整合到每天的常規工作中。每次收到標本時，應采用兩種方法檢測，即當前方法和驗證方法，并保存數據以供日后進行統計比較。累積的數據應定期進行審核，以確保各類體液都能得到驗證。如兩種方法的相關性較差，應在標本中查找各種常見原因。

對小型實驗室而言，要收集到能滿足驗證研究所需的標本數量會很困難。但只有有足夠的標本量才能做到有效統計，并確保儀器能提供真實的結果，特別是在醫學決定值處。在QMP－LS的實際問卷調查中也涉及了驗證標本用量問題。結果顯示實驗室使用的標本量各不相同，有的為1～10份，有的甚至＞80份。為了能有效統計，對每一種標本類型建議至少使用40份標本進行研究。

三、自動體液分析

用于自動計數的體液標本的處理過程不同于外周血標本。因此，體液標本自動計數的標準操作規程應包括標本處理、儀器模式更改和標本檢測等所有步驟。

1.標本前處理制造商聲明的預期用途必須表明標本檢測前是否須做特殊處理，如滑膜液標本需用透明質酸酶進行預處理，以降低其黏度。

2.背景核查在檢測任何標本、尤其是CSF標本前，應確保吸樣通道清潔，以避免標本受污染。如在開蓋模式下檢測，對進樣針外部進行清潔也是規范實驗室的做法。背景計數必須≤空白值下限，否則應重做;如復做后背景計數仍很高，則需對儀器應進行清洗或維護。

3.處理假性結果的程序陽性檢測結果必須進一步復核，否則不應當接受。當檢測結果陽性時，大多數檢測系統會報警。實驗室操作程序應規定體液標本發生報警時應如何進行調查以及采取的措施。這些程序應包括如何檢出造成假性結果的各種碎片或細胞團塊以及表明是否有必要使用替代的計數方法。調查方法可以是外觀檢查或濕片顯微鏡檢查。如實驗室操作程序檢測不可替代的標本(如CSF、關節腔積液等)，則報告中應有對異常情況(如肉眼可見的凝塊、鏡下細胞退變)和對結果準確性影響程度的描述。

4.結果超出報告范圍的處理程序實驗室必須確定每種體液的可報告上限和下限(見“AMR和線性”部分)。當檢測結果超出實驗室驗證的AMR時，實驗室應有處理超出可報告范圍上限和下限標本的書面程序，包括結果超出AMR后實施稀釋的程序。

5.測量單位QMP－LS的調查結果顯示參與調查的實驗室使用了不同的測定單位，這可能會造成臨床醫生的困惑。因此，實驗室須表明用于報告體液細胞計數的單位，建議自動體液計數使用與全血細胞計數相同的測量單位，這樣還可以消除可能導致錯誤結果的計算過程。在患者報告中也應明確標明所用測量單位。

四、質量控制

1.室內質量控制須對定量檢測體液標本的分析系統進行質量控制。雖然有可用的商品化體液質控品，但也存在一些困惑，即有無必要做獨立的質控或是否可接受日常使用的商品化CBC質控品。新型的血液分析儀均具有特定的體液檢測模式。重要的是要了解此模式的檢測通道、吸樣路徑、標本稀釋、報告模式、計數體積或細胞分析是否與CBC模式不同。如體液標本采用不同于CBC計數的檢測方法，就要有獨立的質控品;也有用于檢測儀器體液AMR下限的商品化質控品。其他還應考慮的是細胞分類計數是否由儀器報告。有些儀器報告兩分類細胞，則商品化體液質控品也應包含此類成分。

2.能力驗證能力驗證是實驗室認可的要求。對實驗室而言，如無來自外部能力驗證計劃的標本，則須用其他方式來證明其檢測能力，如采用盲樣檢測或實驗室之間的標本交換檢測及比對，以達到法規的要求。

綜上所述，除儀器所分析的體液類型不同外，對體液細胞自動計數儀進行的確認/驗證應與外周血細胞標本自動計數儀的確認/驗證一樣，其中最重要的是要確定體液細胞低值計數的正確性和精密度。驗證/確認的目的就是確定儀器是否適合其預期用途，并識別任何潛在的誤差。此誤差可導致錯誤結果，有可能會影響患者的診療。

[1]BOUMER G，DE LA SALLE B，GEORGE T.et al.ICSH guidelines for the verification and performance of automated cell counters for body fluids[J].Int J Lab Hematol，2014，36(6):598－612.

Introduction of the ICSH guidelines for the verification and performance of automated cell counters for body fluids，2014 edition

HU Xiaobo1，YAO Yiting2，WANG Qing3，XIONG Lifan4.(1.No.3 People's Hospital Affiliated to Shanhai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 201900，China;2.St.Luke's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200050，China;3.Shanghai Centre for Clinical Laboratory，Shanghai 200126，China;4.Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200001，China)

This article introduces the 2014 edition of International Committee for Standardization in Hematology (ICSH)guidelines for the verification and performance of automated cell counters for body fluids.This guideline provides the particular methods and requirements for laboratories to verify the performance of automated cell counters in the aspects of accuracy，precision，patient correlation，carryover，limits of detection，analytical measurement range，etc.Meanwhile they specify that laboratories should execute the verification of their automated cell counters for different body fluids.

Automated cell counts;Body fliuds;Cerebrospinal fluid;Verification

1673－8640(2015)03－0209－05

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.001

2015－02－16)

(本文編輯:龔曉霖)

胡曉波，男，1969年生，碩士，主任技師，主要從事臨床檢驗基礎研究。