柴胡皂苷對體外發酵參數及細菌數量變化的影響

潘龍，牛俊麗，卜登攀，杜洪，程建波，孫先枝，王秀敏，秦俊杰，袁耀明，張幸開

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,動物營養學國家重點實驗室，北京 100193；2.CAAS-ICRAF農用林業與可持續畜牧業聯合實驗室，北京 100193；3.東北農業大學食品安全與營養協同創新中心，黑龍江 哈爾濱 150030；4.北京生泰爾生物科技有限公司，北京 102206；5.上海光明荷斯坦牧業有限公司，上海 200436)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different small letters mean the significant differences at P<0.05, the same below.

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柴胡皂苷對體外發酵參數及細菌數量變化的影響

潘龍1**，牛俊麗1**，卜登攀1,2,3*，杜洪1，程建波1，孫先枝1，王秀敏4，秦俊杰4，袁耀明5，張幸開5

(1.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,動物營養學國家重點實驗室，北京 100193；2.CAAS-ICRAF農用林業與可持續畜牧業聯合實驗室，北京 100193；3.東北農業大學食品安全與營養協同創新中心，黑龍江 哈爾濱 150030；4.北京生泰爾生物科技有限公司，北京 102206；5.上海光明荷斯坦牧業有限公司，上海 200436)

研究柴胡皂苷(SSA)對體外發酵指標及發酵液中菌群變化的影響。采用完全隨機試驗設計，在0.5 g全混合日糧(TMR)中分別添加0，0.125，0.25和0.5 mg的SSA，通過AGRS-III微生物發酵微量產氣自動記錄儀在39℃條件下進行48 h體外發酵，并通過實時定量PCR(RT-PCR)檢測發酵液中菌群相對含量的變化。結果表明，0.25 g/kg的SSA提高了干物質降解率(DMD，P=0.08)和總產氣量(GP，P<0.05)，并提高了發酵液中揮發酸(VFA)的含量(P<0.05)，而0.5和1.0 g/kg的SSA對GP和DMD沒有顯著的影響，但是提高了乙酸和TVFA的含量(P<0.05)。SSA提高了白色瘤胃球菌和牛鏈球菌的相對含量(P<0.05)；但降低了短普雷沃氏菌和噬淀粉瘤胃桿菌的相對含量(P<0.05)。因此，SSA提高了體外GP和VFA濃度，并改變發酵液中細菌的含量，這表明SSA有利于調控微生物體外發酵參數。

柴胡皂苷；體外發酵；細菌數量

柴胡是傳統中藥，含有豐富的化學成分，包括柴胡皂苷、甾醇、脂肪油、揮發油和多糖等[1-3]，具有解熱退燒、鎮靜安神、抗炎抗病毒、提高免疫力等多種生物活性[4]，因此具有很高的營養和藥用雙重價值[5]。本課題研究表明，柴胡中草藥添加劑可以緩解奶牛熱應激并提高其泌乳性能[6]，但其緩解畜禽熱應激的效果及機制尚不明確[7]。

長期大量使用柴胡添加劑會對肝臟有一定的損傷作用[8]。柴胡水提物可致小鼠肝臟損傷，其毒性機理可能與小鼠肝臟的氧化-抗氧化系統平衡受到破壞有關[9]。柴胡總皂苷醇洗脫物損傷肝組織，且隨著劑量增大損傷程度越嚴重，谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶也顯著升高；不同劑量的總皂苷醇洗脫物對小鼠肝組織出現不同程度的肝細胞水腫和脂肪變性，其中高劑量甚至出現組織片狀壞死、小葉結構不清等不良癥狀[10]。此外，藥理實驗證實柴胡可抑制胃液分泌，降低胃蛋白酶活性[11]；高劑量的柴胡水提液還可抑制正常動物的胃排空和腸蠕動[12]。因此，使用柴胡中草藥時一定要慎重考慮其適宜的添加劑量，才能充分發揮其潛在的生物學功效[13]。

植物皂苷類物質調節瘤胃發酵越來越受到廣泛關注[14]。1%～3%的苜蓿皂苷降低瘤胃發酵液pH值，提高總揮發酸(total volatile fatty acids，TVFA)和氨態氮(NH3-N)的濃度[15]；但1%～3%的苜蓿皂苷降低瘤胃原蟲培養液TVFA濃度，2%和3%的苜蓿皂苷降低了培養液微生物蛋白(microbial crude protein，MCP)濃度[16]；鳳仙花明顯降低甲烷生成，促進NH3-N向MCP轉化，改變了瘤胃代謝模式[17]；蒺藜皂苷降低體外發酵液NH3-N和乙酸濃度，但提高丙酸濃度以及飼料能量和蛋白質的利用效率[18]；皂樹苷和絲蘭皂苷可直接刺激一些瘤胃細菌的發育，從而提高飼料消化率[19]；絲蘭皂苷降低NH3-N濃度，但提高瘤胃淀粉桿菌、普雷沃菌和丁酸弧菌的豐度[20]，苜蓿皂苷的發酵液中主要細菌類型為鏈球菌[21]等。由此可知，多種皂苷可以改變瘤胃發酵參數，并改變其中細菌含量而優化瘤胃發酵。

藥理學研究表明，柴胡具“營養”和“藥用”的雙重價值，其主要活性成分為柴胡皂苷[5]。目前，柴胡皂苷(SSA)主要應用于提高機體抗炎和免疫調節功能[4]，而應用于調控奶牛瘤胃發酵報道較少，因此，本試驗通過體外法研究SSA對體外發酵參數的影響，從而為優化瘤胃發酵提供選擇參考。

1 材料與方法

1.1 產氣裝置與產品來源

產氣裝置為中國農業大學楊紅建老師發明的AGRS-III微生物發酵微量產氣自動記錄儀(Automated Trace Gas Recording System for Microbial Fermentation, 簡稱AGRS)。柴胡皂苷A(saikosaponin A，SSA)于2014年1月購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗設計與處理

準確稱取約0.5 g飼料樣品(按牛場日糧配制成全混合日糧，total mixed ration，TMR)于150 mL厭氧發酵瓶中，按照完全隨機試驗設計，4種處理添加量分別為0，0.25，0.5和1.0 g/kg，將每個瓶中分別加入相應SSA劑量(0，0.125，0.25和0.5 mg；由于SSA易潮解且量極少，稱量困難，為此，配成1 mg/mL溶液，即加入0，125，250，500 μL)，每處理5個重復。接種時迅速將每個瓶中加入預熱的緩沖液50 mL和4層紗布過濾的新鮮瘤胃液25 mL，并向瓶中持續通入CO25 s后，立即加上瓶塞，并將每個發酵瓶與產氣裝置的每個傳感器相連接，于39℃下連續培養48 h，試驗重復3次。

1.3 樣品采集與測定分析

1.3.1 瘤胃液樣品采集與處理 2014年1月在北京市順義區某奶牛場通過瘤胃瘺管采集3頭健康奶牛晨飼前的瘤胃內容物，混合后裝于保溫瓶迅速帶回實驗室，39℃水浴環境中用4層紗布過濾，同時通入CO2，然后邊攪拌邊加入厭氧發酵瓶，操作應在盡量短的時間內完成[22]。

1.3.2 發酵液樣品采集與處理 發酵48 h后結束發酵程序，從發酵瓶中采集發酵液，即時測量發酵液pH；并采集10 mL發酵液，-20℃冷凍保存，用于揮發性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)指標的測定和DNA提取[23]。對剩余的發酵液進行過濾，用于體外干物質降解率(dry matter digestibility，DMD)指標的測定[24]。

1.3.3 DNA提取和細菌相對定量 通過CTAB珠磨法提取發酵液中DNA[25]；利用引物在ABI 7500 Real-Time PCR System上進行qPCR相對定量。qPCR擴增體系如下：5.0 μL SYBR? Premix Ex Taq?(2×)，0.3 μL PCR上游引物(10 μmol/L)，0.3 μL PCR下游引物(10 μmol/L)，0.2 μL ROX Reference Dye Dye II(50×)，1 μL DNA樣品(稀釋至10 ng/μL)，3.4 μL ddH2O，總體積為10 μL。qPCR反應程序為：95℃預變性30 s，95℃ 5 s，55℃ 34 s，72℃ 34 s，40個循環；每個樣品3個重復。以空白組相應Ct值為對照，將樣品各種菌和總菌的Ct值通過公式2-ΔΔCt(2-[Δ(Ct樣品-Ct總菌)-Δ(Ct空樣-Ct空總)])得到相對百分含量。

1.4 數據處理與分析

用Excel 2003軟件初步整理后，采用SAS 9.2軟件中的GLM模型進行分析。采用Tukey方法進行多重比較，以最小二乘均數形式表示統計結果，差異顯著水平為P<0.05，趨于顯著水平為0.05≤P<0.10。

2 結果與分析

2.1 柴胡皂苷對體外產氣的影響

SSA對發酵液的pH沒有顯著影響(表1)，但是0.25 g/kg的添加量趨于(P=0.08)提高DMD(圖 1)，同時也提高了總產氣量(gas production，GP，P<0.05)；而0.5和1.0 g/kg的添加量具有提高DMD和GP的趨勢，但差異均不顯著(圖2)。

表1 柴胡皂苷A對體外產氣的影響

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:The different small letters mean the significant differences atP<0.05, the same below.

2.2 柴胡皂苷對發酵液中揮發酸含量的影響

由表2可知，SSA對VFA的影響較大，其中0.25 g/kg的添加量提高了丙酸和丁酸含量(P<0.05)，0.25，0.5和1.0 g/kg的添加量均提高了乙酸和TVFA的含量(P<0.01)，對乙丙比影響不顯著(P>0.05)，并沒有改變瘤胃的發酵模式。

2.3 柴胡皂苷對發酵液中微生物數量的影響

由表3可以看出，SSA提高了白色瘤胃球菌和牛鏈球菌的含量(P<0.05)，并有提高布氏普雷沃氏菌的(P=0.08)與脂厭氧弧菌(P=0.04)的趨勢；但卻降低了短普雷沃氏菌、噬淀粉瘤胃桿菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的含量(P<0.05)，有降低產琥珀酸絲狀桿菌的趨勢(P=0.08)。

圖1 柴胡皂苷A對DM體外降解率的影響Fig.1 Effect of SSA on DMD in vitro

圖2 柴胡皂苷A對體外產氣量的影響Fig.2 Effect of SSA on GP in vitro

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different small letters mean the significant differences atP<0.05, the same below.

表2 柴胡皂苷A對發酵液揮發酸含量的影響

表3 柴胡皂苷A對發酵液中微生物相對含量的影響

3 討論

體外研究表明低劑量的皂樹苷和絲蘭皂苷可直接刺激一些瘤胃細菌的發育，包括纖維分解菌，從而提高飼料消化率，并能調節瘤胃微生物群落，且有劑量依賴性；而高劑量皂苷在調節瘤胃發酵特性上與驅除原蟲類似[19]。絲蘭皂苷可能由于直接抑制了蛋白降解菌，從而降低了氨氮濃度；但其增加了瘤胃新月形單胞桿菌和瘤胃淀粉桿菌、瘤胃普雷沃菌和丁酸弧菌的豐度，盡管增加幅度較小[20]。本試驗結果也表明，低劑量的SSA的添加提高了DMD，也相應提高了體外GP，但是高劑量的添加卻又導致結果出現降低的趨勢(表1)。GP高(圖1)表明飼料在瘤胃內的發酵活動劇烈，這和DMD的趨勢(圖2)相互驗證。但也有研究表明絲蘭皂苷并沒有影響DMD[26]，這可能與皂苷的類型和添加劑量有關。

添加劑量為75 mg/L的絲蘭皂苷時可顯著提高VFA產量，而225 mg/L添加劑量使VFA產量降低[27]，本試驗也表明0.25 g/kg的SSA提高了丙酸和丁酸的含量，而0.5和1.0 g/kg的添加量又有降低的趨勢(表2)；但是也有研究表明體外添加皂樹皂苷[28]、絲蘭提取物[26]或無患子果實[29]對總VFA產量沒有影響；洋槐(black locust)皂苷提高了丙酸的濃度，但對TVFA沒有顯著影響[30]；混合日糧中添加125 mg/kg絲蘭皂苷顯著提高了丙酸濃度，但對于精料型日糧的效果不明顯[31]。此外，pH為5.5時，30 mg/L 絲蘭屬植物(含8%皂苷)提高丙酸濃度，降低乙酸比例，但在pH為7.0時則沒有效果[32]。因此，皂苷對瘤胃VFA產量的作用效果可能與皂苷的來源、添加量、日糧精粗比和瘤胃pH有關。本試驗表明柴胡皂苷的添加(0.25，0.5 和1.0 g/kg)均提高了乙酸和總揮發酸的含量(表2)，這與其他報道相一致[33]。

瘤胃作為一個龐大的菌種資源庫，存在著大量的微生物。反芻動物對粗飼料的利用能力遠遠高于單胃動物，主要歸功于瘤胃中棲息的微生物菌群。由于瘤胃中細菌和真菌的種類不同，對皂苷的敏感度也有所不同。毛瓣無患子(Sapindusrarak)皂苷濃度小于1 mg/mL時，白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌不受其影響，但是當其濃度添加到2～4 mg/mL時，其數量都顯著下降[34]。毛瓣無患子皂苷在短時間內能夠抑制白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌，而105 d后，白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌均不受影響[35]。因此，不同種類的皂苷及不同的作用時間對瘤胃細菌的影響均可能不同。葫蘆巴籽皂苷和印度田菁葉子的皂苷使產琥珀酸絲狀桿菌的含量分別提高42%和45%，而飛廉植物葉子和葫蘆巴籽皂苷可使黃色瘤胃球菌的數量提高40%[36]。苜蓿皂苷(8～16 g/d)顯著提高了綿羊瘤胃中主要纖維分解菌(產琥珀酸擬桿菌、黃化瘤胃球菌及白色瘤胃球菌)占總細菌數的相對含量[37]。鮮沙蔥和提取物能夠顯著提高瘤胃產琥珀酸絲狀桿菌和白色瘤胃球菌相對數量，但對黃化瘤胃球菌的相對數量沒有顯著影響[38]。而本試驗研究表明，1.0 g/kg的SSA提高了白色瘤胃球菌的數量，但又有降低產琥珀酸絲狀桿菌數量的趨勢(表3)。這與上述研究不同，可能由于不同來源的皂苷或者作用時間長短對瘤胃微生物的影響不盡相同。

絲蘭皂苷對于淀粉分解菌的抑制作用因種屬差異變化較大，皂苷可抑制牛鏈球菌、棲瘤胃普雷沃氏菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的生長，而對反芻獸新月形單胞菌的生長卻有刺激作用[27]。而該試驗表明，0.5 g/kg的SSA抑制了棲瘤胃普雷沃氏菌的含量，不同劑量均抑制了噬淀粉瘤胃桿菌，這與上述研究結果一致，但是SSA顯著提高了牛鏈球菌的數量，這與其他學者研究結果相反。關于皂苷對某些細菌的促生長作用機理尚不明確。有學者認為，可能與皂苷對原蟲的抑制作用有關[39]，或者是因為低劑量的皂苷使細胞膜的滲透作用增強，進而使細菌細胞能夠吸收更多的養分[40]。生產中可利用皂苷對不同微生物的影響調控瘤胃代謝，如飼喂精料型日糧的反芻動物，其瘤胃內牛鏈球菌的數量較多，促使可溶性淀粉迅速發酵為乳酸，乳酸過多易引起瘤胃酸中毒，因而在高精料日糧中添加適量皂苷則可通過抑制牛鏈球菌的生長而減少酸中毒的發生率[41]。因此，研究皂苷對體外發酵以及菌群的影響具有現實意義。

4 小結

SSA提高了體外發酵的GP和DMD，并提高了發酵液中TVFA的濃度，也相應改變了其中的菌群相對含量，但并沒有改變瘤胃發酵模式。SSA可能通過促進發酵液中的細菌生長，從而提高了TVFA和GP，調控瘤胃的發酵。因此，SSA可以優化菌群，促進瘤胃發酵。

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Effects of saikosaponin oninvitrofermentation parameters and bacterial quantity

PAN Long1**, NIU Jun-Li1**, BU Deng-Pan1,2,3*, DU Hong1, CHENG Jian-Bo1, SUN Xian-Zhi1,WANG Xiu-Min4, QIN Jun-Jie4, YUAN Yao-Ming5, ZHANG Xing-Kai5

1.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.WordAgroforestryCenter,EastandCentralAsia,Beijing100193,China; 3.SynergeticInnovationCenterofFoodSafetyandNutrition,NortheastAgriculturalUniversity,Haerbin150030,China; 4.BeijingCentreBiologyCo.,Ltd.,Beijing102206,China; 5.ShanghaiBrightHostanCo.,Ltd.,Shanghai200436,China

An experiment was conducted to investigate the effects of saikosaponin (SSA) oninvitrofermentation parameters and bacterial quantity. Four treatments consisting of supplemental SSA at 0, 0.25, 0.5, and 1.0 g/kg dry matter (DM) were combined with 0.5 g total mixed ration (TMR), 50 mL basal media and 25 mL rumen fluid obtained from ruminally cannulated, lactating Holstein dairy cows. The treatments were randomly assigned to 5 of 20 incubation bottles. Cumulative gas production (GP) was continuously monitored by an automated trace gas recording system (AGRS-III, Beijing) at 39℃ during the 48 h incubation. Relative content of the bacterial community in theinvitroculture fluid was analyzed by real-time quantitative PCR. The results revealed that SSA at 0.25 g/kg could increase dry matter degradability (DMD,P=0.08), total gas production (GP,P<0.05) and the concentration of acetate, propionate and total volatile fatty acids (TVFA) (P<0.05). Adding SSA at 0.5 and 1.0 g/kg level did not affect GP kinetics and DMD, while it increased the concentration of acetate and TVFA (P<0.05). The supplement of SSA increased the relative quantity ofRuminococcusalbusandStreptococcusbovis(P<0.05), but decreased the content ofPrevotellabrevisandRuminobacteramylophilus(P<0.05). Therefore, SSA supplementation improved gas production, increased VFA concentrations and the quantity of major microbial species in theinvitroculture fluid, which indicates that SSA may be beneficial for the manipulation of rumen microbial fermentationinvitro.

saikosaponin;invitrofermentation; bacterial quantity

10.11686/cyxb2014213

http://cyxb.lzu.edu.cn

2014-04-25；改回日期：2014-12-01

“十二五”科技支撐計劃(2012BAD12B02-5)，中國農業科學院科技創新工程(ASTIP-IAS07)和動物營養學國家重點實驗室自主課題(2004DA125184G1103)資助。

潘龍(1988-)，男，江蘇徐州人，在讀碩士。E-mail:panlong8809@163.com。牛俊麗(1990-)，女，新疆塔城人，在讀碩士。E-mail:niujunliwxy@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work. *通訊作者Corresponding author. E-mail: burdenpan@gmail.com

潘龍, 牛俊麗, 卜登攀, 杜洪, 程建波, 孫先枝, 王秀敏, 秦俊杰, 袁耀明, 張幸開. 柴胡皂苷對體外發酵參數及細菌數量變化的影響. 草業學報, 2015, 24(6): 85-91.

Pan L, Niu J L, Bu D P, Du H, Cheng J B, Sun X Z, Wang X M, Qin J J, Yuan Y M, Zhang X K. Effects of saikosaponin oninvitrofermentation parameters and bacterial quantity. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 85-91.