內(nèi)源性硫化氫對急性非結(jié)石性膽囊炎NF-κB的保護作用

高守為，余保平，楊 斌，潘陳為，胡桂英，張 麗

（1.武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060；2.黑龍江省康復醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

內(nèi)源性硫化氫對急性非結(jié)石性膽囊炎NF-κB的保護作用

高守為1，2，余保平1，楊 斌1，潘陳為1，胡桂英1，張 麗1

（1.武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060；2.黑龍江省康復醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

目的 探討急性非結(jié)石性膽囊炎(AAC)中NF-κB的表達及內(nèi)源性硫化氫的保護作用。方法采用膽總管結(jié)扎(BDL)方法構建AAC動物模型；40只成年豚鼠被隨機分為正常組(normal組)、假手術對照組(sham組)、BDL-48 h組(BD-48 h組)和炔丙基甘氨酸(PAG)+BDL-48 h組(PAG組)，每組10只。造模48 h后收集各組膽囊組織及動物血清。HE染色評價膽囊炎癥并測定各組膽囊組織胱硫醚γ-裂解酶(CSE)活性；全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和膽紅素(Bilirubin)水平；免疫組織化學法和Western blot法分別檢測各組膽囊組織中CSE、NF-κB p65的表達。結(jié)果PAG組炎癥評分均明顯高于BDL-48 h組、normal組和sham組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與normal組和sham組比較，BDL-48 h組和PAG組豚鼠血清ALT、AST、Bilirubin水平及膽囊組織CSE活性均明顯增高(P＜0.05)，其中，PAG組CSE活性明顯低于BDL-48 h組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；免疫組織化學法和Western blot法顯示，PAG組膽囊的NF-κB p65蛋白水平均明顯高于BDL-48 h組、normal組和sham組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論NF-κB的活化參與了急性非結(jié)石性膽囊炎的病理過程，內(nèi)源性硫化氫可能通過抑制NF-κB的表達，從而減輕膽囊的炎癥程度。

急性非結(jié)石性膽囊炎；NF-κB；內(nèi)源性硫化氫

NF-κB(Nuclear factor-κB)廣泛存在于體內(nèi)各種細胞，調(diào)節(jié)著眾多與炎癥反應有關的細胞因子及炎癥介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄。在急性非結(jié)石膽囊炎(Acute acalculous cholecystisis，AAC)中，NF-κB被激活，其異常表達與AAC的發(fā)生、發(fā)展密切相關[1]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[2]，硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)對AAC的炎癥起抑制作用，但其具體作用機制尚未明確。本研究在前期研究的基礎上進一步探討內(nèi)源性H2S對AAC中NF-κB的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年豚鼠40只，雄性，體質(zhì)量250～350 g，由武漢大學人民醫(yī)院動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級，室溫20℃～25℃，濕度40%～60%。CSE活性檢測相關試劑及PAG均購于美國Sigma公司；CSE多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體及β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；NF-kappaB抗體購自Cell Singaling公司；羊抗兔二抗、Western blot相關試劑分別由北京中杉金橋公司、碧云天生物技術公司提供。

1.2 方法 動物隨機分為正常組(normal組)、假手術對照組(sham組)、膽總管結(jié)扎48 h組(BDL-48 h組)和PAG+膽總管結(jié)扎48 h組(PAG組)，每組10只。

1.2.1 模型構建 參照文獻[3]：3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射，麻醉后將動物固定。腹部備皮，0.5%聚維酮碘溶液消毒。無菌手術刀于劍突下沿腹中線切口，游離膽總管，在膽道進入十二指腸入口處，采用3～0線結(jié)扎膽總管，動作輕柔，對膽囊不進行任何操作。依次縫合肌層、皮膚，消毒傷口并包扎。假手術組不結(jié)扎膽總管，其他操作與上述相同；PAG組動物在術前30 min腹腔注射PAG(50 mg/kg)，余操作與模型組一致。以上手術步驟均遵循無菌操作原則。待動物清醒后，分別將其轉(zhuǎn)移到籠內(nèi)(可自由進食水)。48 h后收集各組動物膽囊標本。

1.2.2 HE染色 取新鮮膽囊標本，4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋、切片。行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。膽囊炎癥評分參照文獻[3]，采用獨立雙盲法。

1.2.3 血清ALT、AST、Bilirubin測定 動物麻醉后打開胸腔，心臟采血3 ml，快速注入促凝管，輕輕顛倒混合，室溫靜止30 min，4 000 r/min離心10 min后分離血清，500 μl分裝，-80℃冰箱保存，采用全自動生化分析系統(tǒng)(ADVIA2400，德國)檢測。

1.2.4 膽囊組織CSE活性測定 參照文獻[4]，準備含有中央小室的錐形瓶。外室反應體系包括0.7 ml的磷酸鉀緩沖液、L-半胱氨酸、5'-磷酸吡多醛和0.3 ml的膽囊組織勻漿。中央小室內(nèi)置入2.0 cm×2.5 cm濾紙，并加入1%醋酸鋅0.5 ml。錐形瓶內(nèi)充入氮氣后密封，37℃搖床孵育90 min后加50%三氯醋酸終止反應。將中央小室內(nèi)容物(濾紙和塑料管)移入到含3.6 ml蒸餾水的試管中，依次加入對氨基二甲基苯二胺鹽酸鹽0.5 ml、三氯化鐵0.4 ml。室溫靜置20 min后，分光光度計(波長為665 nm)測量吸光度，每孔測3次，取平均值。然后根據(jù)NaHS標準曲線計算溶液中H2S含量。

1.2.5 Western blot法檢測膽囊組織NF-κB、CSE蛋白含量 分別提取各組膽囊組織的細胞核蛋白、總蛋白，BCA法測定其蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)移至NC膜。先后行一抗(NF-κB p65或CSE)、二抗孵育。洗膜后在化學發(fā)光成像儀中曝光；利用凝膠成像分析系統(tǒng)測得各目標帶的光密度值。NF-κB p65相對表達量=目的蛋白條帶光密度值/β-actin條帶光密度值；CSE相對表達量=目的蛋白條帶光密度值/GAPDH條帶光密度值。

1.2.6 免疫組化法檢測膽囊組織NF-κB p65、CSE蛋白表達 膽囊組織經(jīng)固定、石蠟包埋后，常規(guī)脫蠟至水和抗原修復。按說明書操作，分別加一抗NF-κBp65、CSE，4℃孵育過夜、隔日加二抗(羊抗兔IgG)孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。然后復染、脫水、透明、封片。結(jié)果判斷：采用獨立雙盲法，NF-κBp65以細胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細顆粒狀著色為陽性細胞，CSE以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色片狀或顆粒狀物為陽性。分別在400倍顯微鏡下，每張切片隨機選10個視野，數(shù)500個細胞，計算陽性率。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，各組比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及組織病理炎癥評分 normal組與sham組炎癥評分比較差異無統(tǒng)計學意義[(1.34± 0.22)分 vs(1.62±0.19)分，P＞0.05]。BDL-48 h組[(5.46±0.27)分]和PAG組[(8.67±0.32)分]炎癥評分較normal組和sham組明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中PAG組炎癥評分明顯高于BDL-48 h組(P＜0.05)。

2.2 各組豚鼠血清ALT、AST、Bilirubin水平 PAG組和BDL-48 h組豚鼠血清ALT、AST、Bilirubin水平均明顯高于normal組和sham組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。而BDL-48 h組與PAG組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 各組豚鼠血生化指標(±s)

表1 各組豚鼠血生化指標(±s)

注：與normal組、sham組比較，aP＜0.05。

normal組(n=10) sham組(n=10) BDL-48 h組(n=10) PAG組(n=10) 40.04±11.48 43.30±12.07 107.21±19.47a134.51±20.57a55.10±13.08 48.40±12.10 984.15±101.49a778.60±92.70a1.87±0.06 2.02±0.07 32.52±3.13a37.05±4.10a

2.3 各組膽囊組織中CSE活性的變化 BDL-48 h組和PAG組膽囊CSE活性均顯著高于normal組和sham組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中，PAG組膽囊CSE活性較BDL-48 h組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組豚鼠膽囊組織CSE活性和NF-κB p65、CSE蛋白表達(±s)

表2 各組豚鼠膽囊組織CSE活性和NF-κB p65、CSE蛋白表達(±s)

注：與normal組、sham組比較，aP＜0.05；與CBDL-48 h組比較，bP＜0.05。

組別NF-κB p65蛋白CSE蛋白normal組(n=10) sham組(n=10) BDL-48 h組(n=10) PAG組(n=10) 0.20±0.01 0.22±0.03 0.49±0.18a0.29±0.10abCSE活性(μmol·min-1·g-1) 23.90±5.18 28.02±4.69 53.69±7.27a37.06±3.90ab0.29±0.02 0.41±0.01 0.54±0.13a0.86±0.14ab

2.4 各組膽囊組織中NF-κB、CSE蛋白含量變化 與normal組、sham組相比較，BDL-48 h組和PAG組膽囊的NF-κB p65、CSE蛋白水平均明顯增高(P＜0.05)，其中，PAG組NF-κB p65蛋白水平明顯高于BDL-48 h組，而CSE蛋白水平明顯低于BDL-48 h組(P＜0.05)，見表2和圖1。

圖1 Western blot檢測各組鼠膽囊組織NF-κB p65、CSE蛋白表達

2.5 各組膽囊組織中NF-κB、CSE蛋白的表達水平 BDL-48 h組和PAG組NF-κB p65陽性染色細胞明顯(定位于細胞核)，陽性細胞百分率較normal組、sham組明顯升高(P＜0.05)，且PAG組NF-κB p65蛋白陽性率明顯高于BDL-48 h組(P＜0.05)，見表3和圖2。CSE蛋白主要定位于胞質(zhì)和胞膜；與normal組、sham組相比，BDL-48 h組和PAG組的CSE免疫陽性細胞百分率顯著升高(P＜0.05)，而PAG組CSE蛋白陽性率較BDL-48 h組明顯降低(P＜0.05)，見表3和圖3。

表3 各組豚鼠膽囊組織NF-κB p65核表達陽性細胞和CSE胞漿表達陽性細胞百分率(±s)

表3 各組豚鼠膽囊組織NF-κB p65核表達陽性細胞和CSE胞漿表達陽性細胞百分率(±s)

注：與normal組、sham組比較，aP＜0.05；與BDL-48 h組比較，bP＜0.05。

組別normal組(n=10) sham組(n=10) BDL-48 h組(n=10) PAG組(n=10) NF-κB p65(%) 11.91±3.42 12.58±2.15 58.28±3.53a87.59±5.06abCSE(%) 15.46±4.12 13.98±3.71 49.92±4.86a31.03±6.59ab

圖2 各組豚鼠膽囊組織NF-κB p65陽性細胞(×400)

圖3 各組豚鼠膽囊組織CSE陽性細胞(×200)

3 討論

H2S是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種具有生物學效應的氣體信號分子，廣泛參與了包括消化系統(tǒng)在內(nèi)的多種疾病的病理生理過程。內(nèi)源性H2S是通過胱硫醚β-合成酶(Cystathionineβ-synthase，CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(Cystathionineγ-lysae，CSE)催化L-半胱氨酸產(chǎn)生的，且CBS、CSE廣泛表達于胃腸道的神經(jīng)、黏膜及平滑肌。前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，豚鼠膽囊存在CBS和CSE，且隨著膽囊炎癥的增加，CBS、CSE的蛋白表達及CSE活性增加。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，H2S在AAC中起抑制炎癥的作用，給予NaHS(即外源性H2S)后，豚鼠膽囊炎癥、水腫減輕。相反，給予CSE抑制劑PAG后，血漿中的H2S合成受到抑制，卻加重了膽囊的炎癥反應和損傷[2]。本研究采用免疫組織化學法及Western blot法顯示，BDL-48 h組加入PAG后，炎癥評分增加，同時CSE蛋白表達及其H2S合成減少，而NF-κB p65表達卻顯著升高，表明內(nèi)源性H2S可能通過抑制NF-κB p65表達，從而減輕膽囊的炎癥程度。

既往研究表明，H2S在體內(nèi)具有抗炎和促炎雙重作用。例如，在燒傷模型小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，外源性H2S可以抑制炎癥相關因子(如IL-8、IL-6、TNF-α)的激增、減少淋巴細胞浸潤、降低細胞間粘附因子1 (ICAM-1)的表達和中性粒細胞的聚集，從而發(fā)揮保護作用[6]。國內(nèi)劉蓓蓓等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥大鼠體內(nèi)給予PAG后，模型大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、MPO水平明顯降低，其炎癥及水腫損傷減輕；然而給予外源性H2S后，則發(fā)現(xiàn)肺的炎癥損傷加重。國外Linden等[8]學者證實，在盲腸結(jié)扎和穿刺引發(fā)的膿毒血癥實驗中，外源性H2S可以促進炎癥反應，加重組織損傷；他們進一步研究發(fā)現(xiàn)，外源性H2S可以激活NF-κB，激活后的NF-κB迅速從胞質(zhì)進入到細胞核，促進炎癥介質(zhì)等基因(如IL-1β、IL-6、TNF-α)的轉(zhuǎn)錄、合成，最終導致炎癥反應加重。這些結(jié)果提示，H2S發(fā)揮抗炎或促炎的作用與炎癥動物模型、作用部位及H2S來源等因素密切相關。

Gomez等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在AAC的發(fā)生、發(fā)展中，NF-κB與膽囊炎癥有著密切的關系。例如，膽囊組織缺血缺氧、膽汁淤積等可以促進NF-κB、COX-2、iNOS等炎癥相關介質(zhì)的表達；而糾正缺血缺氧等因素后NF-κB活性明顯降低[1]。此外，使用NF-κB活化抑制劑抑制NF-κB活化后可以顯著改善梗阻性黃疸時腸道黏膜的通透性，并阻止全身炎癥反應的擴大[9]。因此，我們推測，NF-κB的活化參與了AAC的病理過程，而內(nèi)源性H2S可以抑制NF-κB激活，減輕炎癥，從而起保護作用。

Zhang等[10]研究顯示，外源性H2S可以減輕肝缺血-再灌注損傷，保護肝功能。在內(nèi)毒素血癥引起的肝臟損傷中加入PAG同樣可以減輕肝臟的損傷，降低ALT、AST值[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，膽道梗阻48 h后血清ALT、AST、Bilirubin濃度均明顯升高，而PAG組較BDL-48 h組差異無統(tǒng)計學意義，產(chǎn)生的原因可能是，急性膽道梗阻時Bilirubin濃度急劇升高，肝細胞損害嚴重。

綜上所述，NF-κB的活化參與了AAC的病理過程，內(nèi)源性H2S可能通過抑制NF-κB的表達從而減輕膽囊的炎癥反應，起保護作用。此外，本研究尚存在一定的局限性，前期已經(jīng)證實，在豚鼠膽囊組織中同時存在合成H2S的兩種關鍵酶：CSE和CBS，本實驗只考慮到了CSE，尚需補充應用CBS的抑制劑作為實驗組進行進一步研究，以得出更為完整的結(jié)論。

[1]Gomez-Pinilla PJ,Camello PJ,Tresguerres JA,et al.Tempol protects the gallbladder against ischemia/reperfusion[J].J Physiol Biochem,2010,66(2):161-72.

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Protective effect of endogenous hydrogen sulfide on nuclear factor-κB during acute acalculous cholecystitis.

GAO Shou-wei1,2,YU Bao-ping1,YANG Bin1,PAN Chen-wei1,HU Gui-ying1,ZHANG Li1.1.Department of Gastroenterology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.The Rehabilitation Hospital of Heilongjiang Province,Harbin 150000,Heilongjiang,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of nuclear factor-κB(NF-κB)in gallbladder during acute acalculous cholecystitis(AAC),and to study the protective effect of endogenous hydrogen sulfide(H2S)on NF-κB.MethodsThe model of AAC in guinea pig was established by common bile duct ligation(BDL),and 40 adult guinea pigs were randomly divided into normal group(normal group),sham control group(sham group),BDL for 48 hours group(BDL-48 h group),and DL-propargylglycine+BDL-48 h group(PAG group).Each group had 10 animals.48 hours after BDL,gallbladder tissues and serum of all animals were collected.Hematoxylin and eosin-stained slides of gallbladder samples were scored for inflammation,and cystathionineγ-lysae(CSE)activity in gallbladder tissue was examined.The level of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST)and bilirubin in serum were detected by full automatic biochemical analysis system.Immunohistochemistry and western blotting were used respectively to determine the expression levels of CSE and NF-κB p65.ResultsThe inflammation score in PAG group was higher than those in normal,sham and BDL-48 h group(P＜0.05).Compared with normal and sham group,the levels of ALT,AST,bilirubin and CSE activity were significantly increased in BDL-48 h and PAG group (P＜0.05).And the CSE activity in PAG group was significantly lower than that in BDL-48 h group(P＜0.05).Immunohistochemistry analysis and western blotting showed that the level of NF-κB p65 protein in PAG group was significantly higher than those in normal,sham and BDL-48 h group(P＜0.05).ConclusionActivation of NF-κB is involved in the pathological process of ACC.And Endogenous H2S may help reduce the inflammation in gallbladder by inhibiting expression of NF-κB.

Acute acalculous cholecystitis;NF-κB;Endogenous hydrogen sulfide

R575.6+1

A

1003—6350（2015）19—2809—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1026

2015-04-18)

國家自然科學基金（編號：81170351）

余保平。E-mail：yubp62@163.com