乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少癥檢測(cè)方法探討

陳愛蓮，馬小宏

（如皋市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 如皋 226500）

乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少癥檢測(cè)方法探討

陳愛蓮，馬小宏

（如皋市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 如皋 226500）

目的探討乙二胺四乙酸依賴性假性血小板減少癥(EDTA-PTCP)幾種檢測(cè)方法的可靠性。方法對(duì)5例EDTA-PTCP患者和20位健康體檢者同時(shí)用經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)、枸櫞酸鈉和肝素鋰三種抗凝管及末梢血稀釋的方式采集標(biāo)本，分別用血液分析儀在三種抗凝管采集標(biāo)本后5min、30min、60min測(cè)定血小板計(jì)數(shù)，采集末梢血用顯微鏡手工計(jì)數(shù)血小板，對(duì)所有標(biāo)本涂片染色觀察血小板形態(tài)。結(jié)果5例EDTA-PTCP患者EDTA-K2采血管采血后30min和60min血小板計(jì)數(shù)(PLT)比5min時(shí)測(cè)定結(jié)果顯著偏低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DTA-PTCP患者EDTA-K2采血后30min和60min抗凝血涂片染色均見明顯的血小板聚集現(xiàn)象，而健康體檢者EDTA-K2抗凝血涂片及未抗凝血直接涂片染色見血小板散在分布。在采血30min后測(cè)定，EDTA-K2采血管PLT明顯低于枸櫞酸鈉、肝素鋰及手工計(jì)數(shù)結(jié)果，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；20例健康體檢者在采血后5min、30min、60min時(shí)EDTA-K2采血管PLT與枸櫞酸鈉、肝素鋰、手工計(jì)數(shù)的結(jié)果比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。結(jié)論對(duì)疑似EDTA-PTCP患者可以用EDTA-K2采血管重新采血立即測(cè)定，或不使用抗凝劑直接抽血立即測(cè)定，也可以使用枸櫞酸鈉或肝素鋰抗凝管初步確認(rèn)，同時(shí)涂片染色并手工計(jì)數(shù)得到正確的結(jié)果。

乙二胺四乙酸；枸櫞酸鈉；肝素鋰；假性血小板減少癥；血小板計(jì)數(shù)

血小板在機(jī)體止血、凝血過(guò)程中具有重要作用，血小板計(jì)數(shù)(Platelets，PLT)是止血、凝血檢查最常用的篩檢試驗(yàn)之一。血液分析儀的廣泛應(yīng)用提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度和效率，減輕了檢驗(yàn)工作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)鹽對(duì)紅細(xì)胞、白細(xì)胞的形態(tài)影響較小，尤其對(duì)血小板計(jì)數(shù)影響較小，最適合作為血細(xì)胞計(jì)數(shù)的抗凝劑。1993年國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICSH)建議將EDTA鹽作為血常規(guī)檢驗(yàn)的抗凝劑在臨床得到廣泛使用。但EDTA能誘導(dǎo)少數(shù)患者血小板聚集，血液分析儀無(wú)法對(duì)其正確識(shí)別，從而造成檢測(cè)值大大低于真實(shí)值。這種由EDTA引起的血小板假性減少的現(xiàn)象被稱為EDTA依賴性假性血小板減少癥(Ethylenediaminetetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)[1]。如不能及時(shí)鑒別EDTA-PTCP，可能導(dǎo)致誤診，可發(fā)生過(guò)度治療或者引起不必要的其他檢查。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)5例血小板假性減少的患者和20位健康體檢者進(jìn)行采血，采用不同的抗凝劑及末梢血稀釋的方式采集標(biāo)本，并涂片染色，分別用血液分析儀在標(biāo)本采集后不同時(shí)間測(cè)定血小板，同時(shí)用顯微鏡人工計(jì)數(shù)、觀察涂片血小板形態(tài)。以驗(yàn)證EDTA-PTCP的幾種檢測(cè)方法的可靠性，為檢驗(yàn)工作人員提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年5～11月在本院就診，經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝靜脈血標(biāo)本血小板檢測(cè)結(jié)果明顯減低，但均無(wú)臨床出血傾向，白細(xì)胞、血紅蛋白、凝血指標(biāo)均正常，經(jīng)即刻采血及外周血涂片檢查明確診斷為EDTA-PTCP患者5例，其中男性2例，女性3例。隨機(jī)選擇20例健康體檢者作為本實(shí)驗(yàn)參照組，其中男性10例，女性10例。

1.2 儀器和試劑 美國(guó)Beckman Coulter LH750血液分析儀及配套試劑，Olympus CX31顯微鏡，改良牛鮑氏計(jì)數(shù)盤，草酸銨稀釋液(自配，用于手工計(jì)數(shù)血小板)，BASO瑞姬氏染色液。EDTA-K2，枸櫞酸鈉和肝素鋰三種真空采血管均使用奧地利非可替公司產(chǎn)品。

1.3 方法 對(duì)EDTA-PTCP患者和健康體檢者，按要求用EDTA-K2、枸櫞酸鈉和肝素鋰三種真空采血管采集靜脈血，顛倒混勻8次，分別于采血后5min、30min、60min用LH750血液分析儀測(cè)定血小板計(jì)數(shù)(PLT)；采集末梢血按照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[2]要求手工計(jì)數(shù)血小板。每個(gè)標(biāo)本測(cè)定兩次取平均值。將上述標(biāo)本涂片染色，顯微鏡下觀察血小板形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值或均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。5例EDTA-PTCP患者EDTA-K2采血管采血后3個(gè)時(shí)間段PLT比較、三種抗凝劑采血后30min時(shí)的PLT及手工計(jì)數(shù)PLT比較采用單因素方差分析；20例健康體檢者EDTA-K2采血管采血后不同時(shí)間段PLT與枸櫞酸鈉、肝素鋰、手工計(jì)數(shù)相應(yīng)觀察時(shí)間段之間PLT差異采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EDTA-K2不同時(shí)間PLT檢測(cè)結(jié)果 5例EDTA-PTCP患者經(jīng)EDTA-K2采血管采血后3個(gè)時(shí)間段的PLT檢測(cè)結(jié)果見表1。EDTA-K2采血管采血后30min時(shí)和60min時(shí)的PLT分別與5min時(shí)PLT檢測(cè)結(jié)果比較明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表15 例EDTA-PTCP患者EDTA-K2采血管不同時(shí)間PLT檢測(cè)結(jié)果(×109/L)

2.2 不同抗凝劑PLT及手工計(jì)數(shù)PLT比較 5例 EDTA-PTCP患者經(jīng)三種采血管采血后30min的PLT及血小板手工計(jì)數(shù)結(jié)果表明：5例患者的EDTA-K2采血管PLT分別為34×109/L、37×109/L、26×109/L、32× 109/L、24×109/L，均明顯低于枸櫞酸鈉采血管PLT(分別為203×109/L、136×109/L、107×109/L、162×109/L、131×109/L)、肝素鋰采血管PLT(分別為237×109/L、143×109/L、124×109/L、191×109/L、139×109/L)及手工計(jì)數(shù)(分別為141×109/L、146×109/L、122×109/L、175× 109/L、145×109/L)的PLT結(jié)果，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 三種抗凝劑30min時(shí)PLT及手工計(jì)數(shù)血小板結(jié)果(×109/L)

2.3 健康體檢者3種抗凝劑PLT及手工計(jì)數(shù)比較 20例健康體檢者經(jīng)三種采血管采血后5min、30min和60min的PLT及相應(yīng)時(shí)間的手工計(jì)數(shù)PLT結(jié)果見表2，結(jié)果表明EDTA-K2采血管采血后各觀察時(shí)間段的PLT與枸櫞酸鈉采血管、肝素鋰采血管、手工計(jì)數(shù)之間PLT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 血涂片鏡檢結(jié)果 5例EDTA-PTCP患者EDTA-K2采血管采血后30min和60min時(shí)抗凝血涂片染色均見明顯的聚集和衛(wèi)星現(xiàn)象；未抗凝直接涂片染色見血小板散在分布(圖2)。20例健康體檢者EDTA-K2抗凝血涂片及未抗凝血直接涂片染色見血小板散在分布，未見明顯的聚集和衛(wèi)星現(xiàn)象。

表2 20例健康體檢者不同時(shí)間段EDTA-K2采血管PLT與枸櫞酸鈉、肝素鋰、手工計(jì)數(shù)之間PLT比較(±s，×109)

表2 20例健康體檢者不同時(shí)間段EDTA-K2采血管PLT與枸櫞酸鈉、肝素鋰、手工計(jì)數(shù)之間PLT比較(±s，×109)

注：表中t值和P值為枸櫞酸鈉、肝素鋰、手工計(jì)數(shù)PLT分別與EDTA-K2采血管PLT進(jìn)行比較。

測(cè)定時(shí)間5min 30min 60minP值0.89 0.88 0.94例數(shù)20 20 20 EDTA-K2222±42 223±44 218±41枸櫞酸鈉198±47 196±45 191±47t值1.70 1.91 1.93P值0.09 0.06 0.06肝素鋰211±49 206±46 209±51t值0.76 1.19 0.68P值0.45 0.24 0.49手工計(jì)數(shù)224±39 221±40 220±40t值0.13 0.15 0.08

圖2 聚集衛(wèi)星現(xiàn)象（A）和正常血小板（B）

3 討 論

隨著血液分析儀的普及和真空采血管的廣泛應(yīng)用，由EDTA-K2引起的假性血小板減少的報(bào)道也逐年增多[3-6]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道EDTA-PTCP發(fā)病率為0.07%～0.21%[7]。由于血液分析儀常將凝集的血小板誤認(rèn)為白細(xì)胞，如過(guò)度依賴血液分析儀，容易引起對(duì)EDTA-PTCP患者的誤診。在血液分析儀的散點(diǎn)圖中，白細(xì)胞閾值線左下方出現(xiàn)明顯的顆粒團(tuán)，儀器常將一些與白細(xì)胞大小相似的血小板聚集體誤認(rèn)為白細(xì)胞，使得血小板結(jié)果偏低，而白細(xì)胞偏高。血液分析儀有血小板聚集(Platelet clumps)報(bào)警提示，所以當(dāng)血液分析儀出現(xiàn)報(bào)警信息時(shí)一定要查看散點(diǎn)圖，并根據(jù)復(fù)片規(guī)則涂片染色，觀察血小板大小、形態(tài)以及有無(wú)聚集。

本研究歷時(shí)7個(gè)月，觀察到的EDTA依賴性假性血小板減少癥患者為5例。用EDTA-K2真空采血管采集患者靜脈血，分別于采血后5min，30min，60min用LH750血液分析儀測(cè)定PLT。檢測(cè)結(jié)果表明，EDTA-K2采血后30min和60min的PLT與5min時(shí)的檢測(cè)結(jié)果相比明顯減少。而5例EDTA-PTCP患者EDTA-K2采血后30min和60min抗凝血涂片染色均見明顯的聚集和衛(wèi)星現(xiàn)象；同時(shí)觀察到EDTA-PTCP患者的未抗凝直接涂片染色與健康體檢者EDTA-K2抗凝血涂片及健康體檢者未抗凝血直接涂片染色一樣，未見明顯的聚集和衛(wèi)星現(xiàn)象，血小板呈散在分布。EDTA-PTCP患者EDTA-K2采血管采血后30min時(shí)的PLT明顯低于相應(yīng)時(shí)間段枸櫞酸鈉采血管、肝素鋰采血管及手工計(jì)數(shù)PLT，而健康體檢者EDTA-K2采血管采血后不同時(shí)間段的PLT與相應(yīng)時(shí)間段枸櫞酸鈉、肝素鋰、手工計(jì)數(shù)PLT之間結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。因此，作者認(rèn)為對(duì)疑似EDTA-PTCP患者可以用EDTA-K2采血管重新采血立即測(cè)定，或不使用抗凝劑直接抽血立即測(cè)定。也可使用枸櫞酸鈉或肝素鋰抗凝管初步確認(rèn)，但要警惕多種抗凝劑引起血小板假性減少[8-10]。在更換抗凝劑的同時(shí)涂片染色并手工計(jì)數(shù)PLT得到正確的結(jié)果。

近年來(lái)，由抗凝劑引起的血小板假性減少得到高度關(guān)注，由于這種假性血小板減少常導(dǎo)致給患者增加許多不必要的檢查，甚至創(chuàng)傷性骨髓穿刺涂片、輸注血小板等治療，給患者帶來(lái)身心痛苦和不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至引起醫(yī)療糾紛。因此，建議臨床醫(yī)生和檢驗(yàn)科醫(yī)生都應(yīng)該對(duì)EDTA-PTCP要有足夠的警惕，工作中遇到首次出現(xiàn)血小板嚴(yán)重減少的患者，特別是無(wú)明顯出血癥狀的患者要認(rèn)真查找原因，及時(shí)溝通，排除檢測(cè)方面的影響因素，為臨床提供正確的結(jié)果，避免臨床誤診誤治。

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Investigation on the detection method for EDTA-dependent pseudothrombocytopenia.

CHEN Ai-lian,MA Xiao-hong.Department of Clinical Laboratory,Rugao People'Hospital,Rugao 226500,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the reliability of the methods for detecting EDTA-dependent pseudothrombocytopenia(EDTA-PTCP).MethodsBlood samples were collected from 5 patients of EDTA-PTCP and 20 healthy subjects by three anticoagulant tubes(EDTA-K2,sodium citrate and heparin lithium)and peripheral blood dilution.Platelets were determined by haematology analyzer 5min,30min,60min after the samples were collected by anticoagulant tubes,as well as determined manually under the microscope for peripheral blood samples collected.Smear staining was performed to observe platelet morphology.ResultsIn the five DTA-PTCP patients,the platelet count of EDTA-K2anticoagulant tube was significantly lower at 30min and 60min after sample collection than at 5min (P＜0.05).Platelet of EDTA-K2anticoagulant tube from the 5 patients showed significant aggregation during smear staining,while the platelet of EDTA-K2anticoagulant tube from the 20 healthy subjects and the peripheral blood(manual counting)showed scattered distribution.30min after blood collection,the platelet count of EDTA-K2anticoagulant tube was significantly lower than that of sodium citrate anticoagulant tube,heparin lithium anticoagulant tube, manual counting(P＜0.05).In 20 healthy subjects,no significant difference exist in the results between EDTA-K2anticoagulant tube and sodium citrate anticoagulant tube,heparin lithium anticoagulant tube,manual counting(P＞0.05).ConclusionFor suspected patients of EDTA-PTCP,blood samples can be collected by EDTA-K2anticoagulant tube or draw directly without anticoagulant for immediate platelet determination.Samples can also be collected by using sodium citrate or lithium heparin anticoagulant tube for initial identification.Smear staining and manual counting should be performed to obtain correct results.

Ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA);Sodium citrate;Heparin lithium;Pseudothrombocytopenia;Platelet count

R558+.2

A

1003—6350（2015）21—3170—03

2015-06-29)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.21.1153

馬小宏。E-mail：1974277014@qq.com