納米銀支架治療重癥膽管炎的機制及抗菌性研究

呼增吉，賈長庫，韓 霖，符 譽，黃小龍

（海南醫學院附屬醫院肝膽外科，海南 海口 570103）

·論 著·

納米銀支架治療重癥膽管炎的機制及抗菌性研究

呼增吉，賈長庫，韓 霖，符 譽，黃小龍

（海南醫學院附屬醫院肝膽外科，海南 海口 570103）

目的 研究內鏡下納米銀支架治療急性重癥膽管炎(ACST)的機制及納米銀支架的抗菌性。方法將20頭豬隨機分為納米銀支架組(n=8)、普通支架組(n=8)和對照組(n=4)。對照組采用內鏡下逆行膽管造影(ERC)，膽總管內注入大腸桿菌，乳頭口用鈦夾夾閉，封閉乳頭。支架組在造模成功后行ERC+支架置入，支架末端在乳頭口處以鈦夾固定。觀察術后豬的一般情況，分別于術前、術后1 d、3 d、5 d采集豬血檢測其白細胞計數、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血清膽紅素(TB)、血清腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-1(IL-1)，觀察豬死亡后的膽管病理改變。結果三組豬術前的各項觀察指標比較差異均無統計學意義(P＞0.05)；術后對照組的白細胞及分類、ALT、ALP、TB、TNF-α和IL-1水平均逐步上升，且在各時點均明顯高于兩支架組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；納米銀支架組和普通支架組在術后第五天白細胞計數及分類、血清TNF-α和IL-1比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論細菌感染和膽道梗阻是ACST的主要病因，內鏡下置入支架治療ACST，微創有效，納米銀支架有抗菌性。

重癥膽管炎；內鏡；納米銀；支架；抗菌性

急性重癥膽管炎(Acute cholangitis of servere type，ACST)亦稱急性梗阻性化膿性膽管炎，是膽道感染和梗阻向嚴重階段發展的過程，是膽道疾病的嚴重感染并發癥。其起病急，發展快，常伴有感染性休克，病死率高。近年來，隨著對ACST的深入研究及內鏡技術在膽道疾病中的廣泛應用，越來越多的ACST患者通過內鏡治療得到救治。本實驗通過在內鏡下逆行膽管造影術(Endoscopic retrograde cholangiography，ERC)建立豬的ACST模型，將納米銀支架置入膽管治療ACST，研究納米銀支架治療ACST的優越性及抗菌性。

1 材料與方法

1.1 納米銀支架制備方法 采用上海辛菖醫療器械公司生產的8.5F×6 cm聚丙烯塑料膽管支架為載體，以硝酸銀為原料，采用化學氧化還原法將納米銀顆粒還原并使之沉積在聚丙烯塑料膽管支架表面，使支架管的內外表面均勻附著上納米銀顆粒。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組 本地雜種豬20頭(海南醫學院動物中心)，體重(16±2)kg，雌雄各半，健康無疾病。隨機分為鈉米銀支架組(n=8)、普通支架組(n=8)和對照組(n=4)。

1.2.2 儀器與試劑 Pentax電子十二指腸鏡，愛爾博高頻電發生器，乳頭切開刀，黃斑馬導絲，納米銀涂層支架，塑料支架(8.5F×6 cm上海辛菖醫療器械公司)，碘海醇造影劑，大腸桿菌菌株(海南醫學院附屬醫院微生物室)。

1.2.3 內鏡下膽管炎造模(對照組) 豬禁水禁食24 h，全身麻醉后在豬口腔內置入一2 cm×12 cm自制的塑料套管，使門齒至咽部直線化(圖1)。采用左側臥位，電子十二指腸鏡經塑料套管進入咽部，經食管、胃腔進入幽門，在幽門下方1.5～2 cm處找到十二指腸乳頭，經乳頭開口插入乳頭切開刀(圖2)，碘海醇造影劑進行膽管造影，證實為膽管后抽出造影劑，經乳頭切開刀膽管內注入大腸桿菌1 ml，注射完畢后經乳頭切開刀向膽管注入空氣0.5 ml，然后用鈦夾夾閉乳頭開口。

圖1 實驗動物

圖2 乳頭插管

1.2.4 膽管塑料支架置入(支架組) 造模后待豬出現高熱，脈率增快后，十二指腸鏡再次進入豬十二指腸腸腔內，異物鉗取出夾閉乳頭口的鈦夾，在預置支架的末端穿過一根4#絲線系成一線圈，沿導絲置入納米銀支架及塑料支架，用推送器將支架推送入膽管內，末端側翼以下的支架留在十二指腸乳頭外，鈦夾通過線圈固定在乳頭口，以防支架脫出。透視下觀察支架的位置是否正常(圖3)。

圖3 X線下支架在位

1.3 觀測指標

1.3.1 一般情況 記錄各組豬的一般情況及病死率。

1.3.2 實驗室檢測 各組豬分別于術前、術后1 d、3 d、5 d采集豬外周靜脈血，檢測其白細胞數及分類、谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphate，ALP)、血清膽紅素(Total bilirubin， TB)、血清腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)。

1.3.3 病理檢查 豬若出現死亡立即行病理解剖，了解死亡原因。術后第5天處死所有豬，取膽管組織行病理學檢查。

1.4 統計學方法 應用SPSS12.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 支架組豬麻醉蘇醒后即可進食，但活動量較術前有所減少，3 d后與術前比較無明顯變化。對照組豬蘇醒后進食量明顯減少，出現精神萎靡不振，躁動不安，高熱，呼吸急促，活動差，尿色深，分別于術后26 h、40 h、48 h、70 h死亡。

2.2 白細胞數及其分類 術前三組豬的白細胞及分類比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，術后對照組豬的白細胞及分類在各個時間點均明顯高于普通支架組及納米銀支架組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；普通支架組與納米銀支架組在術后第5天白細胞計數及分類組間比較也有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 血清 TNF-α和 IL-1水平 術前三組TNF-α、IL-1的差異無統計學意義(P＞0.05)，對照組術后TNF-α、IL-1在各時點明顯高于普通支架組和納米銀支架組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；普通支架組與納米銀支架組在術后第五天血清TNF-α、IL-1組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.4 血清ALT、ALP和TB水平 術前三組ALT、ALP和TB的差異無統計學意義(P＞0.05)，術后對照組ALT、ALP和TB在各時點明顯高于普通支架組和納米銀支架組，差異有統計學意義(P＜0.05)；術后普通支架組、納米銀支架組組間比較無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.5 病理改變 豬死亡后立即行病理解剖，腹腔內有腹水形成，膽管內見大量膿液(圖4)。普通支架組膽管壁血管擴張充血，中性粒細胞廣泛浸潤，病理切片中見到大量中性粒細胞聚集，有小膿腫形成；納米銀支架組散在杯狀細胞，血管輕度充血，少量中性粒細胞浸潤。

圖4 術后解剖

表1 三組手術前后血液多項指標的變化(±s)

表1 三組手術前后血液多項指標的變化(±s)

組別對照組普通支架組納米支架組時間術前術后24 h術后72 h術后5 d術前術后24 h術后72 h術后5 d術前術后24 h術后72 h術后5 d白細胞計數(×109/L) 6.70±1.40 17.40±2.70 23.17±1.14 -5.90±0.85 15.30±1.80a13.60±4.30a11.17±4.10a7.20±0.62 11.35±2.50a9.23±1.50a7.33±2.14b中性粒細胞(%) 0.640±0.035 0.890±0.042 0.920±0.031 -0.683±0.045 0.861±0.020a0.802±0.035a0.750±0.031a0.653±0.043 0.935±0.026a0.650±0.012a0.42±0.015bTNF-α(pg/ml) 65.30±4.35 161.2±11.3a189.0±7.45a-55.30±6.30 133.1±15.4a103.2±13.4a93.40±6.10a62.40±7.60a96.10±4.65 89.60±6.41a66.10±4.65bIL-1(pg/) 75.60±15.20 192.1±20.45a256.4±29.70a-65.30±4.30 146.1±7.46a115.2±8.50a97.00±4.50a68.50±7.35a115.1±6.50a90.60±7.65a68.50±4.52bALT(U/L) 7.50±2.35 170.5±37.50 238.5±41.20 -7.30±1.50 56.0±10.60a33.10±5.60a26.10±4.80a7.40±1.24 45.10±8.90a27.10±4.90a30.10±3.50aALP(U/L) 44.20±12.23 178.0±38.50 376.5±61.80 -35.40±10.25 50.6±11.70a43.12±9.30a40.00±9.00a32.20±9.65 46.2±12.30a40.40±8.40a35.65±7.64aTB(μmmol/L) 8.50±2.54 156.50±37.4 232.00±41.20 -6.55±3.12 16.36±2.74a10.90±1.05a8.10±1.80a7.50±1.20 15.80±1.10a9.36±1.70a8.25±0.35a

注：TNF;血清腫瘤壞死因子，LL;白細胞介素，ALT;谷丙轉氨酶，TB；血清膽紅素。‘與對照組同時點比較，‘與普通支架組同時點比較，P<0.05。

3 討 論

急性重癥膽管炎(ACST)是急性膽管炎的嚴重階段，起病急,病情發展快,常伴有膿毒癥及感染性休克,病死率高。ACST的發病機制是由于膽道梗阻后膽道系統壓力增高、經膽汁進入肝內的細菌直接返流進入血液，細菌大量繁殖引起膽管內化膿性感染，繼而引起全身化膿性感染。因此膽道梗阻與細菌感染是重癥膽管炎的發病基礎。急性膽管炎時，如果膽道梗阻未解除，膽管內細菌引起的感染沒有得到控制，逐漸發展至ACST并威脅患者的生命[1]。內鏡下治療ACST具有快速、方便、診斷準確、微創等優越性，目前已成為治療ACST的主要手術方式[2-3]。

因為豬來源廣，且與人類的解剖結構相近，實驗用它來制作ACST模型。和其他實驗者采用開腹手術建立模型不同，本實驗采取內鏡下通過十二指腸乳頭行膽管插管來建立ACST模型，根據膽道梗阻和細菌感染是重癥膽管炎發病的基礎，在膽管內注射大腸桿菌,鈦夾夾閉乳頭口來制作ACST模型，該方法操作方便簡單，模型可靠，微創，避免了開放手術對動物生理機能的干擾[4]。造模成功后，內鏡下置入膽道支架，為防止支架脫落，支架末端縫扎一線圈，鈦夾夾閉腸壁固定。結果表明，對照組動物蘇醒后進食量明顯減少，出現精神萎靡，煩躁不安，體溫驟升，呼吸急促，活動差，最終導致死亡。支架組除進食及活動稍有減少外，一般情況與術前無明顯變化；主要是支架組放置支架解除了梗阻，引流了感染灶，故癥狀較輕，術后恢復快。

在炎性反應過程中TNF-α出現最早而且是最重要的炎性介質,能夠激活淋巴細胞和中性粒細胞，調節其他組織的代謝活性，促使其他細胞因子(如IL-6、IL-8等)的釋放，是許多炎性反應的中心介質[5]。IL-1也是促炎細胞因子，是在全身炎癥反應中起核心作用的細胞因子[6]。因此將炎癥因子TNF-α，IL-1作為主要觀察指標。術后對照組血清TNF-α，IL-1指標在各時點明顯高于支架組(P＜0.05)。對照組因為大腸桿菌持續釋放內毒素,內毒素是刺激細胞因子分泌最主要的物質，在內毒素等抗原的激活下，單核巨噬細胞系統產生和釋放的多種細胞因子和炎性介質顯著升高。而支架組由于膽道支架的引流作用使炎癥的逐漸減輕。對照組血清ALT，ALP和TB水平顯著高于支架組(P＜0.05)，可能與膽道梗阻后，膽道壓力增高致細菌感染及內毒素反流造成肝臟損傷有關。

銀是一種安全廣譜的抗菌材料。銀被納米化后兼具銀元素與納米材料的特性，具有更優良的抗菌效果[7]。納米銀是指在1～100 nm之間的金屬銀微粒組成的粉體，是以納米技術為基礎研制而成的新型抗菌產品，由于其顆粒極其微小，表面積較大，使其具有顯著的表面效應、量子尺寸效應和量子隧道效應，因而具有其他無機抗菌劑無可比擬的抗菌療效，而且安全性高、持久強[8]。

術后5 d電鏡下觀察無論是普通支架組還是納米銀支架組均可觀察到支架下段粘附細菌較中段、上段明顯密集，提示接觸十二指腸返流物機會多的部位細菌生物膜形成明顯。普通支架粘附的細菌密集、菌群種類和數量多，而納米銀支架表面粘附的細菌明顯較少，可見較多為結晶顆粒。國內外學者研究證實[9-10]，對包括金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、腸球菌、淋球菌、念珠菌等在內的十余種微生物的研究發現，納米銀對不同微生物的生物被膜的形成有不同的抑制作用。分析白細胞、TNF-α、IL-1發現，術后5 d納米銀支架組與術前比較差異無統計學意義(P＞0.05)，而普通支架組較納米銀支架組明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。通過膽管組織學發現，雖然兩組都有膽管壁組織水腫、血管充血擴張、炎癥細胞的浸潤，但普通支架組炎癥更為嚴重，有的膽管壁內可以看到膿腫形成。結合術后白細胞水平、TNF-α、IL-1變化，筆者認為納米銀支架可以減少細菌生物膜的形成，抑制支架表面細菌的粘附，具有明顯抗菌的作用。

本研究結果表明，細菌感染和膽道梗阻是ACST的主要發病因素，內鏡下膽管內支架置入內引流微創治療ACST療效確切，納米銀膽管支架具有明顯抗菌作用。

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Mechanism of nano silver stents in the treatment of acute cholangitis of severe type and the antibacterial property of nano silver stents.

HU Zeng-ji,JIA Chang-ku,HAN Lin,FU Yu,HUANG Xiao-long.Department of Heptatobiliary Surgery,the Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570103,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the mechanism of nano silver stents in the treatment of acute cholangitis of severe type(ACST)and the antibacterial property of nano silver stents under endoscope.MethodsTwenty pigs were randomly divided into nano silver stent group(n=8),ordinary stent group(n=8)and control group(n=4).The control group was treated by endoscopic retrograde biliary imaging(ERC),followed by injectingE.colithrough bile duct and enclosing papilla with titanium clips.The nano silver stent group and ordinary stent group were treated by ERC combined with stent implantation,followed by enclosing papilla with titanium clips.The peripheral blood samples were collected pre-operatively and at 1 day,3 day,5 day post-operatively for detection of white blood cell(WBC),alanine aminotransferase(ALT),alkaline phosphate(ALP),total bilirubin(TB),tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-1(IL-1).The pathological changes of bile duct were observed when the pigs were executed.ResultsThere were no significant differences between three groups pre-operatively.The changes of peripheral WBC,ALT,ALP,TB,TNF-αand IL-1 levels post-operatively in control group increased gradually,which were significantly higher than nano silver stent group and ordinary stent group(P＜0.05).The changes of peripheral WBC,TNF-αand IL-1 levels in ordinary stent group and nano silver stent group showed statistically significant difference at 5 day post-operatively(P＜0.05).ConclusionInfection and biliary obstruction are the main cause of ACST.Endoscopic stent implantation is minimally invasive for treatingACST,and nano silver stent has antimicrobial properties.

Acute cholangitis of severe type;Endoscope;Nano silver;Stent;Antibacterial property

R657.4+5

A

1003—6350（2015）23—3433—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.23.1247

2015-06-30)

2013年海南省衛生廳課題(編號：瓊衛2013—資助032號)

呼增吉。E-mail：huzengji@126.com