MTDH在肝細胞癌發(fā)展過程中的表達及意義

羅義歡，劉泳汝，譚 忠，熊貨杰，史振鴻，楊麗樺，黨裔武

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科1、腫瘤內科2，廣西 南寧530021)

MTDH在肝細胞癌發(fā)展過程中的表達及意義

羅義歡1，劉泳汝1，譚 忠1，熊貨杰1，史振鴻1，楊麗樺2，黨裔武1

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科1、腫瘤內科2，廣西 南寧530021)

目的探討異黏蛋白(MTDH)的表達與肝細胞癌(HCC)發(fā)生發(fā)展的關系及其意義。方法應用免疫組織化學方法檢測89例肝癌及其癌旁肝組織，37例肝硬化和25例正常肝組織中MTDH蛋白以及CD34，血管內皮生長因子(VEGF)，腫瘤轉移抑制基因蛋白(nm23)、p53、p21、Ki-67的表達，并分析MTDH與臨床病理參數(shù)以及系列免疫組化指標的相互關系。結果HCC組MTDH的陽性率為57.3%，明顯高于肝硬化組織的29.7%和正常肝組織的24.0%，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；MTDH的表達與腫瘤的T分級、遠處轉移、HBV感染、不同程度微血管密度、nm23以及Ki-67的表達密切相關(P＜0.05)；61例肝癌隨訪中，總平均復發(fā)時間為(57.841±3.025)個月，MTDH陽性表達組的平均復發(fā)時間為（47.791±4.226)個月，低于陰性表達組的(59.418±3.507)個月，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論MTDH可能是一個潛在的評估HCC進展和預后的新生物學標志物，對肝癌的侵襲轉移、血管生成等起重要作用。

肝細胞癌；異黏蛋白；免疫組織化學；轉移

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球性高發(fā)的惡性腫瘤，每年有近78.25萬的新發(fā)病例[1]。過去的十年，由于HCC確診多為晚期，故發(fā)病率呈平穩(wěn)升高趨勢。近年的研究顯示異黏蛋白(Metadherin，MTDH)在多種人類腫瘤中過表達，故檢測其表達有助于早期診斷和判斷腫瘤進程及預后。在多種人類腫瘤細胞中的研究顯示MTDH異常表達可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移、新生血管形成等特性[2-8]。MTDH在HCC中的表達在國內外已有相關研究[9-11]，但是MTDH在HCC不同發(fā)展進程中的研究鮮見報道。因此，本研究采用免疫組織化學技術檢測正常肝組織、肝硬化、癌旁肝組織以及HCC組織中MTDH的表達，并進一步結合部分常見生物標記物以及HCC患者的臨床病理參數(shù)探討MTDH在肝癌發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗標本 收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科2008年3月至2011年2月根治性手術切除且病理證實的HCC及對應癌旁組織標本89例，肝硬化組織37例，正常肝組織25例。HCC標本中，男性72例(80.9%)，女性17例(19.1%)；年齡27～73歲，平均49歲；其中有61例采用電話隨訪2～70個月，至隨訪結束時，復發(fā)9例，未復發(fā)52例。本研究獲得院倫理委員會批準，標本以及各項臨床病理資料的收集均遵守赫爾辛基宣言。

1.2 實驗試劑 MTDH兔抗人單克隆抗體購自美國Epitonics公司，稀釋度為1:200，二抗SupervisionTM檢測系統(tǒng)購自上海長島生物技術有限公司，DAB顯色系統(tǒng)購自福州買新生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 MTDH、CD34、內皮生長因子(VEGF)、腫瘤轉移抑制基因蛋白(nm23)、p53、p21、Ki-67蛋白的免疫組化染色(IHC)采用二步法，操作嚴格按照試劑說明書進行。染色結果由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片及雙評分半定量積分法評分，凡細胞核內和(或)細胞質內中出現(xiàn)棕黃色顆粒者視為MTDH表達陽性細胞。每例組織隨機計數(shù)片中10個高倍視野中陽性細胞率，無陽性染色細胞為0分，陽性染色細胞＜10%為1分，陽性染色細胞11%～50%為2分，陽性染色細胞51%～80%為3分，陽性染色細胞＞80%為4分；顯色程度按照切片內細胞顯色有無和深淺評分，細胞內無染色為0分，呈淡黃色為1分，棕黃色為2分，呈棕色為3分；最后兩分相乘，乘積＞3分的均看作陽性表達[12]。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，使用χ2檢驗分析MTDH在不同臨床病理參數(shù)及免疫組化指標中的表達差異，使用Kruskal-WallisH檢驗分析MTDH在不同分化程度組織中的表達差異。Spearman秩相關檢驗用于分析MTDH的表達與病理參數(shù)及免疫組化指標的相關性。生存分析使用Kaplan-Meier法、Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MTDH在HCC及非癌肝組織中的表達 MTDH的表達主要在細胞核和細胞質中，見圖1。其在HCC組織中的陽性率為57.3%，高于癌旁組織的42.7%，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.798，P＞0.05)，HCC組織中MTDH陽性率明顯高于肝硬化組織的29.7%及正常肝組織的24.0%，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=7.950、8.659，P≤0.05)，見表1。

表1 不同病變的肝組織MTDH的表達[例（%）]

圖1 MTDH在不同病變肝組織中的表達

2.2 MTDH表達與臨床病理參數(shù)的關系 MTDH在病理分期為Ⅲ～Ⅳ組，有遠處轉移組，HBV感染組表達的陽性率明顯高于分期為Ⅰ～Ⅱ組，無遠處轉移組，無HBV感染組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Spearman秩相關法分析顯示，MTDH的表達與病理分期(r=0.216，P=0.043)，遠處轉移(r=0.256，P=0.015)及HBV感染(r=-0.227，P=0.033)顯著相關。MTDH的表達與患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、肝硬化、包膜、癌栓、脈管轉移、HCV感染無明顯相關(P＞0.05)，見表2。

表2 MTDH的表達與HCC臨床病理特征的關系

2.3 MTDH與其他免疫組化指標的關系 CD34表達結果用微血管密度(Microvessel density，MVD)表示，其中MVD高表達組MTDH表達的陽性率70.6% (24/34)顯著高于MVD較小組49.1%(27/55)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.969，P=0.046)。同時，MTDH的表達在nm23、Ki-67陽性組明顯高于對應的陰性組[64.0%(48/75)：21.4%(3/14)，χ2=8.739，P=0.003；74.4% (32/43)：41.3%(19/27)，χ2=9.961，P=0.001]，見表3。Spearman秩相關法分析顯示MTDH的表達與MVD (r=0.211，P=0.047)、nm23(r=0.313，P=0.003)、Ki-67 (r=0.335，P=0.001)顯著相關。然而MTDH的表達與VEGF、p53、p21的表達無明顯相關(P＞0.005)。

2.4 MTDH表達與HCC復發(fā)的關系61例隨訪病例中，9例復發(fā)，其中4例MTDH表達陰性，5例MTDH表達陽性?？偲骄鶑桶l(fā)時間為(57.841±3.025)個月，MTDH陰性表達組平均復發(fā)時間為(47.791±4.226)個月，低于陽性表達組的(59.418±3.507)個月。經(jīng)Kaplan-Meier和Log-rank檢驗方法分析了MTDH對患者復發(fā)率的影響(見圖2)，結果顯示其差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.668，P=0.414)。

表3 MTDH的表達與其他免疫組化指標的關系

圖2 MTDH蛋白的表達與HCC患者復發(fā)的關系

3 討 論

MTDH又名星形膠質細胞升高基因1(Astrocyte elevated gene，AEG-1)，定位于染色體8q22.1，該染色體是HCC等多種腫瘤細胞系中相關基因突變的熱點區(qū)域[13]。近年的研究顯示MTDH是一個癌基因，在多種惡性腫瘤中高表達，如：黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、結直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、肝細胞肝癌、食道鱗癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌等[2-11]。MTDH的高表達參與H-ras、NF-κB及Wnt/β-catenin等多個重要的信號調控通路，從而發(fā)揮調控細胞轉化、凋亡、增殖、遷移和腫瘤轉移的作用。雖然MTDH的致癌作用已被證實，但它作為一個癌基因的潛在功能和作用機制尚未完全明確。本研究采用免疫組化方法初步探討了MTDH蛋白在HCC發(fā)展的不同階段中的表達，結果表明HCC組織中MTDH的表達呈逐漸升高趨勢，故本課題組推測其在HCC發(fā)生發(fā)展過程中起促癌的作用。然而與預測不相符的是MTDH在正常肝、肝硬化和癌旁肝組織中的表達沒有明顯差異，是否MTDH只在肝硬化發(fā)展至HCC階段中通過上調其表達而發(fā)揮促癌作用，或者是因為該幾組樣本量偏少而引起的偏差有待進一步研究證實。

結合臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，MTDH的表達與HCC的病理分級及其遠處轉移密切相關，可見MTDH是促進HCC進一步發(fā)展的一個關鍵作用因子。該結果與龔振斌[14]的研究報道相一致，其研究發(fā)現(xiàn)MTDH的表達水平與HBV相關的HCC患者的病理分期、組織分化程度、血管侵犯、T分級、N分級之間密切相關。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)MTDH的表達與HBV感染呈負相關，HBV感染組反而出現(xiàn)MTDH低表達。HBV與HCC關系已成共識，因此我們推測HBV感染與MTDH的表達可能有相互抑制的作用，其相關的作用機制尚未見報道，有待進一步的深入研究。

高血管密度是HCC的特征之一，在HCC快速生長過程中，腫瘤容易出現(xiàn)缺氧和缺乏營養(yǎng)素，因此腫瘤細胞會釋放VEGF等激活內皮細胞以促進血管形成。本研究中我們通過檢測標記物CD34判斷HCC腫瘤組織中的微血管密度，結果發(fā)現(xiàn)MTDH的表達與腫瘤MVD正相關，高MVD組其表達明顯升高。HCC微陣列分析顯示MTDH可以調節(jié)多個與侵襲、轉移、血管形成相關基因的表達，如促進血管生成素(Angiopoietin)-1，并增加了腫瘤MVD；同時其經(jīng)PI3K/AKT途徑增加了臍靜脈內皮細胞侵襲能力及在基質膠中管狀結構的形成，后者與酪氨酸激酶受體2(Tie2)的表達相關，siRNA干擾Tie2后顯著抑制此成管能力[15]。乳腺癌中的研究也證實MTDH表達與MVD和VEGF表達之間呈現(xiàn)明顯的正相關[2]。

本研究結果顯示MTDH的表達量隨著病理分級上升而增加，與Ki-67蛋白的表達亦呈正相關。MTDH的表達在發(fā)生遠處轉移組明顯高于無轉移組，然而卻與nm23蛋白的表達呈正相關，是否因為nm23陰性組樣本數(shù)過少而導致結果的偏差有待進一步增加樣本研究證實，其余結果均與相關報道比較一致。Emdad等[16]在永生性大鼠胚胎成纖維細胞中穩(wěn)定表達MTDH可使細胞發(fā)生形態(tài)學改變且侵襲性增強，表達MTDH的大鼠胚胎成纖維細胞克隆可引發(fā)裸鼠腫瘤形成；Kang等[17]的研究表明MTDH的過表達能增加腫瘤的轉移能力和侵襲性，當沉默MTDH基因后能降低人腫瘤的轉移和侵襲；MTDH在乳腺癌細胞系中的異常表達能增強細胞增殖能力和在軟瓊脂上的生長能力，而通過RNA干擾后則抑制細胞增殖和克隆形成能力[2，9]。因此，MTDH可望成為HCC病理分級以及轉移等腫瘤預后相關的一個參考指標。

[1]Cai ZQ,Si SB,Chen C,et al.Analysis of prognostic factors for survival after hepatectomy for hepatocellular carcinoma based on a bayesian network[J].PLoS One,2015,10(3):e0120805.

[2]Li C,Li R,Song H,et al.Significance of AEG-1 expression in correlation with VEGF,microvessel density and clinicopathological characteristics in triple-negative breast cancer[J].Journal of Surgical Oncology,2011,103(2):184-192.

[3]Wan L,Kang Y.Pleiotropic roles of AEG-1/MTDH/LYRIC in breast cancer[J].Advances in Cancer Research,2013,120:113-134.

[4]Li G,Wang Z,Ye J,et al.Uncontrolled inflammation induced by AEG-1 promotes gastric cancer and poor prognosis[J].Cancer Research,2014,74(19):5541-5552.

[5]Song H,Tian Z,Qin Y,et al.Astrocyte elevated gene-1 activates MMP9 to increase invasiveness of colorectal cancer[J].Tumour biology:the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine,2014,35(7):6679-6685.

[6]Wang YP,Liu IJ,Chiang CP,et al.Astrocyte elevated gene-1 is associated with metastasis in head and neck squamous cell carcinoma through p65 phosphorylation and upregulation of MMP1[J].Molecular Cancer,2013,12(1):109.

[7]He W,He S,Wang Z,et al.Astrocyte elevated gene-1(AEG-1)induces epithelial-mesenchymal transition in lung cancer through activating Wnt/beta-catenin signaling[J].BMC Cancer,2015,15:107.

[8]Jung HI,Ahn T,Bae SH,et al.Astrocyte elevated gene-1 overexpression in hepatocellular carcinoma:an independent prognostic factor [J].Annals of Surgical Treatment and Research,2015,88(2):77-85.

[9]Yu C,Chen K,Zheng H,et al.Overexpression of astrocyte elevated gene-1(AEG-1)is associated with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)progression and pathogenesis[J].Carcinogenesis,2009,30(5):894-901.

[10]Song H,Li C,Lu R,et al.Expression of astrocyte elevated gene-1: a novel marker of the pathogenesis,progression,and poor prognosis for endometrial cancer[J].International Journal of Gynecological Cancer,2010,20(7):1188-1196.

[11]Song E,Yu W,Xiong X,et al.Astrocyte elevated gene-1 promotes progression of cervical squamous cell carcinoma by inducing epithelial-mesenchymal transition via Wnt signaling[J].International Journal of Gynecological Cancer,2015,25(3):345-355.

[12]許良中,楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準[J].中國癌癥雜志,1996,6(4):229-231.

[13]Poon TC,Wong N,Lai PB,et al.A tumor progression model for hepatocellular carcinoma:bioinformatic analysis of genomic data[J]. Gastroenterology,2006,131(4):1262-1270.

[14]龔振斌.異黏蛋白(metadherin)在肝細胞肝癌中的表達及其作用[D].西安:第四軍醫(yī)大學,2012.

[15]Yoo BK,Emdad L,Su ZZ,et al.Astrocyte elevated gene-1 regulates hepatocellular carcinoma development and progression[J]. The Journal of Clinical Investigation,2009,119(3):465-477.

[16]Emdad L,Lee SG,Su ZZ,et al.Astrocyte elevated gene-1(AEG-1) functions as an oncogene and regulates angiogenesis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(50):21300-21305.

[17]Kang DC,Su ZZ,Sarkar D,et al.Cloning and characterization of HIV-1-inducible astrocyte elevated gene-1,AEG-1[J].Gene,2005,353(1):8-15.

Significance of MTDH expression in the developing process of hepatocellular carcinoma.

LUO Yi-huan1,LIU Yong-ru1,TAN Zhong1,XIONG Huo-jie1,SHI Zhen-hong1,YANG Li-hua2,DANG Yi-wu1.Department of Pathology1, Departmetn of Medical Oncology2,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning530021, Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of metadherin(MTDH)and the carcinogenesis of hepatocellular carcinoma(HCC)and its related significance.MethodsImmunohistochemistry was adopted to detect the expression levels of MTDH,CD34,vascular endothelial growth factor(VEGF),nm23,p53,p21 and Ki-67 in a cohort of89 pairs of HCC tissues and their matched adjacent hepatic tissues,37 cases of hepatocirrhosis tissues and25 cases of normal hepatic tissues.Meanwhile,we analyzed the correlation between MTDH and several clinicopathological parameters as well as some immunohistochemical indexes.ResultsThe positive rate of MTDH expression in HCC tissues(57.3%)was significantly higher than that in either hepatocirrhosis tissues(29.7%)or normal hepatic tissue(24.0%,P＜0.05).The MTDH expression was closely related to T category,distant metastasis,HBV infection,microvessel density and the expression of nm23 and Ki-67(P＜0.05).For the61 cases of HCC which were followed up,the overall average recurrence time was(57.841±3.025)months,and no statistical significance was found between MTDH-positive group[(47.791±4.226)months]and MTDH-negative group[(59.418±3.507)months],P＞0.05.ConclusionMTDH might be implicated as a crucial part in invasion,metastasis and angiogenesis in HCC, which has the potential to be a novel biomarker for the assessment of the development and prognosis of HCC.

Hepatocellular carcinoma;Metadherin;Immunohistochemistry;Metastasis

R735.7

A

1003—6350（2015）22—3288—04

2015-05-15)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.22.1194

國家自然科學基金(編號：81560489)；廣西自然科學基金(編號：2015GXNSFBA139157)；廣西教育廳科研項目(編號：LX2014075)；廣西醫(yī)科大學青年科學基金項目(編號：GXMUYSF201311)；廣西衛(wèi)生廳科研課題(編號：Z2014054)；廣西醫(yī)科大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(編號：201410598003)。

黨裔武。E-mail：dangyiwu@126.com