人體肝癌細胞系SMMC-7721非顯帶技術下的核型分析

范 寧，高 磊，汪 艷，米亞靜，景曉紅

(1.西安醫學院臨床醫學院，陜西 西安710021；2.西安醫學院基礎醫學部細胞生物學與遺傳學教研室，陜西 西安710021)

人體肝癌細胞系SMMC-7721非顯帶技術下的核型分析

范 寧1，高 磊1，汪 艷1，米亞靜2，景曉紅2

(1.西安醫學院臨床醫學院，陜西 西安710021；2.西安醫學院基礎醫學部細胞生物學與遺傳學教研室，陜西 西安710021)

目的應用非顯帶技術，分析人體肝癌細胞系SMMC-7721的染色體核型。方法體外培養SMMC-7721細胞，通過秋水仙素使細胞同步化，低滲、滴片、吉姆薩染色，進行非顯帶染色體核型分析。結果數目方面，SMMC-7721細胞系核型的眾數為60～70條，峰值主要出現在E組，通過分析染色體數目在50～70個之間的較清晰的25個核型發現，E、F、G組染色體總數大多過半甚至超過60%；結構方面，分辨出雙著絲粒染色體、含有3個著絲粒的染色體和環狀染色體。結論上述染色體的數目異常與結構畸變，對認識肝細胞的轉化、惡變以及臨床的初步診治提供了細胞遺傳學基礎。

SMMC-7721；非顯帶；核型分析；超二倍體

原發性肝癌是一種危害性較大的惡性腫瘤，過去對肝癌的研究，多采用由致癌劑誘發的肝癌動物模型，但這種動物的肝癌模型畢竟和人體肝癌的生物學特性存在著相當大的差異[1]。因此，我們通過體外培養人體肝癌細胞株SMMC-7721，利用非顯帶技術對其進行染色體核型分析，為認識肝癌細胞的遺傳學特性提供實驗數據。

1 資料與方法

1.1 細胞培養 SMMC-7721傳代培養2～3 d，待細胞生長密度為70%～80%，加1μg/ml秋水仙素作用4～6 h。胰酶消化細胞，用1640培養基和10%胎牛血清終止消化，離心，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞1次，再離心，棄上清。

1.2 低滲處理 加入0.075 mol/L KCl低滲液至6ml，輕輕混勻，37℃水浴20min。

1.3 預固定 加入固定液(甲醛:冰醋酸=3:1)1ml，輕輕混勻。預固定2min，1500 r/min離心10min，棄去上清液，保留底部細胞。

1.4 固定 加入固定液至8ml，混勻固定30min，1500 r/min離心8min，棄去上清液。重復固定一次。

1.5 滴片 加至1ml固定液制成細胞懸液，懸空15～20cm滴1～2滴細胞懸液至冰水中取出的載玻片上，迅速過酒精燈火焰烤片3～5min。

1.6 染色 在標本上加數滴吉姆薩染液，染色20～30min，用水沖洗。

1.7 顯微鏡觀察 在低倍鏡下找到短小似棒狀處于分裂中期細胞的染色體，轉換油鏡繼續觀察，選擇染色體分散、沒有重疊且團聚性較好的細胞，通過圖像采集系統Motrc Images Advanced3.2鏡下采圖，拍照，計數，分析腫瘤細胞染色體數目與結構。

2 結果

本次標本共采集了153個細胞進行染色體分析，肝癌細胞系SMMC-7721在傳代培養過程中仍保持其上皮細胞的形態。

2.1 數目方面 在153個核型中：①SMMC-7721細胞系染色體數目的眾數出現在60～70條(圖1)。②擁有65條染色體的細胞21個，68條染色體的細胞9個。我們進一步分析了染色體數目在50～70個之間的較清晰的25個核型發現。③C組染色體的數目在A、B、C、D組中最多。④各細胞中數目異常的峰值多出現在E組(表1)。⑤E、F、G組染色體總數40%～50%4個，50%～60%15個，60～70%6個，大多達到50%甚至超過60%。

圖1 SMMC-7721非顯帶核型中染色體的數目分布

表125個核型中E、F、G組染色體數目統計表

圖2 SMMC-7721非顯帶核型中染色體的結構異常

2.2 結構方面 在非顯帶技術下，標本中可見1～4個數目不等的雙著絲粒染色體(圖2A)、三著絲粒染色體(圖2B)以及環狀染色體(圖2C)。其中，具有1個、2個、3個、4個雙著絲粒染色體異常的核型個數為9個、7個、3個、1個，具有三著絲粒染色體的核型個數為5個，具有環狀染色體異常的核型個數為10個。

3 討 論

關于SMMC-7721細胞系的染色體數目變化，分析結果較董榮春等[1]在染色體數目上有不同程度的增加，這可能是不同實驗室獲得同一個細胞株后，在離體培養和傳代過程中細胞發生演變造成的，還發現有近90%(137/153)的標本其染色體屬于超二倍體，可能與肝癌細胞在有絲分裂時染色體不分離或染色體缺失有關，而無絲分裂、核內不均等分裂也可能參與了數目畸變的形成[2]。而核型數為(65,68)的標本出現的頻率較高，可能是在此狀態下更有利于肝癌細胞的存活。關于為何在25個核型里C組染色體數目在A、B、C、D組中最多，已有文獻報道，C組內的8號染色體存有癌基因，11號染色體的長臂是斷裂重接位點，已知該位點既是頻發斷裂點又是脆性位點和癌基因位點，因此，8號與11號染色體均以較高的頻率參與腫瘤染色體的重排[3]。關于為何在25個核型中E組出現峰值以及E、F、G組染色體總數大多過半甚至超過60%，我們分析，前者可能是因為E組的17號染色體長臂含有脆性位點17q11，而該位點與癌基因位點eib-A-1相近，參與肝癌細胞的轉化和癌變[4]；后者可能是由于A、B、C大染色體組的染色體缺失、斷裂從而形成了近似E、F、G組大小的染色體，而這些染色體中同樣含有較多的癌基因和脆性位點，共同導致了肝細胞的惡變[5]。

從結構上看，出現了雙著絲粒染色體，分析是由于非同源染色體的缺失斷裂之后，含有著絲粒的染色體兩兩組合形成的。至于出現含有三個著絲粒的染色體，一方面可能是因為在非顯帶技術下將扭曲或粘連的染色體誤認為含有三個著絲粒的染色體，另一方面也可能是因為兩條染色體在形成過程中各自末端缺失，第三條染色體兩個末端均有缺失，繼而這三條染色體的四個粘性末端連在一起。由于含有三個著絲粒染色體的細胞屬于不穩定性染色體畸變，在其傳代以及生長時，將會因為基因重復、缺失以及形成新的結構畸變而造成對細胞個體致命的損傷。環狀染色體的出現可能是因為一條染色體的長臂和短臂均出現缺失形成粘性末端[2]，而后相連形成環狀，或者染色體在復制分裂過程中兩條姐妹染色單體同側缺失形成粘性末端后自身相連成為部分環狀。然而，上述數目異常和結構異常發生的確切原因，有待于進一步的染色體顯帶或FISH等技術確定。

通過上述研究，分析肝癌細胞轉化、惡變的可能過程是：大染色體含有較多的脆性位點和癌基因[1]，進而頻發斷裂形成粘性末端并暴露癌基因，然后發生重組，形成等臂、雙著絲粒染色體[2]，促使原癌基因激活，最終加速細胞惡變[6-8]。上述關于腫瘤細胞染色體的核型分析將對肝癌細胞的轉化，癌變提供一定的細胞遺傳學基礎。

[1]董榮春,周榮華,呂發度,等.SMMC-7721人體肝癌細胞株的建立及其生物學特性的初步觀察[J].第二軍醫大學學報,1980,1(1):5-9.

[2]左 伋.人類染色體//何俊林.醫學遺傳學[M].6版.北京:人民衛生出版社,2013:104-116.

[3]周后龍,鞏 麗,張 偉,等.原發性肝癌8號和16號染色體雜合子丟失的研究[J].現代腫瘤醫學,2012,20(6):1134-1137.

[4]李福才,孫開來,李呈姜,等.人體肝癌細胞系SMMC-7721的高分辨染色體研究[J].中國醫科大學學報,1988,17(4):259-263.

[5]曹 巖,劉 紅,劉永紅.肝癌患者淋巴細胞染色體脆性部位與原癌基因的相關性[J].吉林大學學報(醫學版),2006,32(4):662-664.

[6]曹來蓉,張超英,紀 靜.脆性部位與原癌基因在乙型肝炎患者中的相關性[J].青島大學醫學院學報,2000,36(2):101-103.

[7]王 娟,倪 虹,陳 力,等.肝癌細胞的染色體變異[J].國外醫學:遺傳學分冊,2004,27(2):90-92.

[8]李生平,王輝云,張昌卿,等.原發性肝癌全基因組雜合性缺失的研究[J].中華醫學雜志,2000,80(8):577-581.

Karyotype analysis of human hepatoma cell line SMMC-7721 using non-banding techniques.

FAN Ning1,GAO Lei1,WANG Yan1,MI Ya-jing2,JING Xiao-hong2.1.Department of Clinic Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an710021,Shaanxi,CHINA;2.Department of Basic Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an710021,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo analyze karyotype of human hepatoma cell lines SMMC-7721 using non-banding technique.MethodsSMMC-7721 cells were culturedin vitro,followed by cell synchronization with colchicine,hypotonic treatment and Giemsa staining,and then non-banding karyotype was analyzed.ResultsThe majority number of karyotypes of SMMC-7721 cell lines was60 to70.Peaks occurred mainly in the E group,and the majority of E,F,G groups were more than half of the total number of chromosomes or even more than60%(25/128).For the structure of chromosomes,dicentric chromosome,chromosome sharing three centromeres and ring chromosome could be found in a few cells.ConclusionThe analysis of the abnormal chromosome will help us to deeply understand transformation and deterioration of liver cells,which provides the genetic basis for preliminary clinical diagnosis and treatment.

SMMC-7721;Non-banding;Karyotype analysis;Hyperdiploid

R735.7

A

1003—6350（2015）20—2967—03

2015-05-13)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.20.1081

西安醫學院校級重點學科細胞生物學、西安醫學院校級精品資源共享課程(編號：XYZL2014-3)；陜西省大學生創新創業計劃(編號：201211840010、201211840011)；陜西省優勢學科建設經費資助

景曉紅。E-mail：Jingxh666@163.com