微載體技術肝細胞體外高密度培養的實驗

楊波，劉寶林，任杰，莊靈霞

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093)

急性肝功能衰竭(ALF)病情危重，死亡率高。生物人工肝支持系統(BALSS)可使ALF 患者順利過渡到肝移植或肝再生，而生物人工肝治療主要依靠大量的肝細胞，一般需要1010個功能良好的肝細胞［1］，因此需求數量巨大。大量高密度和高活性肝細胞只能在體外高密度增殖培養。建立一種體外高密度增殖細胞并能較長時間維持細胞功能的培養方法，對于生物人工肝的發展有重要意義。

由于肝細胞的貼壁依賴性，在高密度條件下，存在細胞接觸抑制效應，細胞的生長和表達會受到嚴重影響［2］，因此體外高密度培養肝細胞需要使用載體材料，以供肝細胞在其粘附生長，細胞在載體材料的粘附是后續細胞增殖生長，進而組織化的關鍵［3-4］。微載體是目前較廣泛使用的載體材料，其比表面積大，可實現細胞高密度培養［5］。國內外研究報道了十余種微載體，材料也分為葡聚糖、明膠、玻璃、纖維素、塑料乃至羥基磷灰石等很多類型，用以培養細胞，取得了良好的效果［6-8］。目前應用較多的是美國GE 公司實體微載體Cytodex 與多孔微載體Cytopore 等，這些微載體，不只是營養物質可以進入其空間，細胞也可以粘附生長。近年來，陸續有Cytodex 與Cytopore 系列載體應用于高密度細胞培養，并取得滿意的結果［9-12］。Cytodex 微載體平均直徑為180 μm，可以使200 個細胞在其表面生長，被廣泛應用于貼壁細胞的生長，尤其是高密度生產病毒疫苗等;利用較多的是生產CHO 細胞，CHO 細胞在微載體Cytodex 的生長密度和數量都比在細胞懸液高很多［13］。大孔微載體Cytopore 能夠為細胞提供貼壁生長的內部空間，細胞在孔洞里可以高密度生長，對貼壁細胞而言，較大的比表面積和多孔的結構可以提高細胞產量［14］。

Cytopore 和Cytodex 這兩種微載體，何種更適合于微重力條件下大規模培養肝細胞，以達到高密度并能維持細胞功能。本課題采用兩種載體進行微重力培養大鼠肝細胞，觀察細胞生長的形態及細胞活力等情況，并通過細胞生長代謝功能中的白蛋白、葡萄糖和尿素等指標測定，探究最佳的微載體濃度和最適宜培養肝細胞的微載體。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大鼠肝細胞;Cytodex 為實心小球微載體(球徑133 ～215 μm);Cytopore 為大孔微載體(平均粒度235 μm);Me2SO(無菌);胎牛血清;1640 培養液;葡萄糖等。Sartorius BP 211D 電子天平;HH.CP-01W 二氧化碳培養箱;立式壓力蒸汽滅菌器;ECLIPSE 55i 顯微鏡;LRM340M 酶標儀;Quanta FEG 場發射環境掃描電子顯微鏡。

1.2 微載體Cytodex 和Cytopore 大鼠肝細胞的培養

1.2.1 培養板的硅化 超凈臺上，取一次性無菌6孔細胞培養板一個，在每個孔中加入60 mL/L 甲基硅樹脂乙醇溶液12 mL，輕輕搖勻，吸出多余的溶液，置60 ℃電烤箱烘干備用。

1.2.2 微載體Cytodex 和Cytopore 滅菌處理 在超凈臺上，干燥的微載體在無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖液(PBS)(每克Cytodex 和Cytopore 各加50 ～100 mL)中在室溫下浸泡膨脹至少3 h。棄去上清液，用新配制的無Ca2+、Mg2+的PBS(每克Cytodex和Cytopore 各加30 ～50 mL)洗滌微載體數分鐘。棄去PBS，換上新的無Ca2+、Mg2+的PBS(每克Cytodex 和Cytopore 各加30 ～50 mL)，然后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌(115 ℃，15 min，15 psi)。所有溶液的pH 應為7.4。

1.2.3 肝細胞接種前的平衡 在超凈臺上，將上述培養板孔中的液體吸出，再用滅菌的無Ca2+、Mg2+的PBS 漂洗1 次，吸棄 PBS，用溫和的含有100 mL/L胎牛血清(FBS)及RPMI 1640 培養基漂洗微載體，將溫度調節37 ℃，培養基的pH =7. 1 ～7.4，通入95%空氣和5%CO2混合氣體，5 min。

1.2.4 大鼠肝細胞的接種 在超凈臺上，將大鼠肝細胞按2 "105cells/mL 的密度接種于含2 g/L 的Cytodex 或Cytopore (作為三維支架材料，形成三維培養環境)的六孔培養板中，補充上述培養基至5 mL，置培養板于37 ℃，5%CO2，100%濕度的二氧化碳培養箱中。

1.2.5 大鼠肝細胞與載體的“相對”靜止培養 前6 h，每15 ～20 min 將培養板取出在超凈臺上，勻速輕柔水平搖晃1 次，6 h 后每1 h 再搖晃1 次，10 h后每2 h 搖晃1 次，每次搖晃時間均為1 ～2 min，16 h停止搖晃，置于培養箱中靜止培養。培養24 h后換液，以后根據培養液顏色和透亮度來更換培養液，每次換去約4 mL 的培養上清。

1.3 測試表征

1.3.1 電鏡的形態學觀察 小心用鑷子取0.5 cm3左右的Cytodex 和Cytopore 支架樣本，放入樣品管內。噴金，噴鍍均勻后掃描電鏡下觀察。

1.3.2 細胞形態學觀察 用倒置生物顯微鏡對培養過程進行觀察拍照。

1.3.3 細胞MTT 值的測定 分別在培養0，2，4，6，8，10 d 時，使用MTT 試劑盒在酶標儀對細胞的MTT值進行測定。

1.3.4 肝細胞的代謝功能 以溴甲酚綠法、二乙酰一肟顯色法、葡萄糖氧化酶法用試劑盒在酶標儀測定白蛋白、尿素和葡萄糖的含量。

2 結果與討論

2.1 實驗結果與分析

多孔載體Cytopore 的表面積為2.8 m2/g，選取0.5 ～2 mg/mL 4 個濃度。Cytodex 比表面積小于Cytopore，實驗選取高于Cytopore 的濃度，選用2.0～3.5 mg/mL 4 個濃度。在細胞培養的第0，2，4，6，8 d，對各個濃度的Cytopore 與Cytodex 進行細胞計數，結果見圖1。

圖1 Cytopore 與Cytodex 濃度與細胞的密度Fig.1 The relationship between specific productivity and cell density whin Microcarrier concentration Cytopore and Cytodex

由圖1a 可知，1.0 mg/mL 濃度的微載體培養出的細胞密度值最大，即細胞生物活性最大、生長增殖快。所以，本實驗所用的 Cytopore 接種濃度為1.0 mg/mL。

由圖1b 可知，3 mg/mL 的微載體細胞密度值最大，故選用3 mg/mL 的接種濃度。

2.2 Cytopore 和Cytodex 的掃描電鏡觀察

由圖2 可知，Cytopore 是多孔載體，以纖維素為基架，其內部存在大量孔洞，細胞可以在其內部生長，Cytodex 是實心球體，以交聯葡聚糖為基架，外表面化學偶聯一層較薄的變性膠原，細胞可以貼附其表面生長。

圖2 掃描電鏡下(a)Cytopore 和(b)CytodexFig.2 SEM images of microcarriers(a)Cytopore and (b)Cytodex

2.3 Cytopore 和Cytodex 的顯微鏡觀察

圖3 Cytopore 培養的肝細胞(×100)Fig.3 Image of cell growth in microcarrier cytopore(×100)(a)培養2 d 后;(b)培養4 d 后;(c)培養6 d 后

圖4 Cytodex 培養的肝細胞(×100)Fig.4 Image of cell growth in microcarrier cytodex(×100)(a)培養2 d 后;(b)培養4 d 后;(c)培養6 d 后

由圖3 可知，Cytopore 微載體大鼠肝細胞培養2 d，微載體空洞內貼附生長的細胞(圖中用箭頭指出)，載體孔隙內充滿密集的細胞，細胞的直徑一般在10 μm。

由圖4 可知，Cytopore 由于載體特殊的孔洞結構，平均孔徑為235 μm，因此細胞生長空間巨大，可以自由生長聚集，一旦粘附于載體，就可以聚集成團生長，不受空間限制，培養至4 d 開始大量貼附于微載體表面，至第6 d 時細胞幾乎貼滿微載體表面，生長至于頂峰，當細胞占滿載體空間后，從第8 d 細胞開始出現凋亡現象。

2.4 Cytopore、Cytodex 微載體培養大鼠肝細胞的MTT 值及代謝指標的對比

分別在培養0，2，4，6，8，10 d 后對Cytopore 與Cytodex 培養的大鼠肝細胞BRL 進行MTT 值及代謝指標的測定，計算各值后作出柱狀圖進行對比。

2.4.1 MTT 值 見圖5。

圖5 微載體培養的大鼠肝細胞MTT 值比較(珋±s)Fig.5 MTT of rat hepatocytes growth in microcarrier

由圖5 可知，Cytopore、Cytodex 微載體培養的大鼠肝細胞所測的MTT 值在前6 d 均呈現上升趨勢，第6 d 時其細胞活性最大，Cytopore 最大達到0.64，Cytodex 最大達到0.53，＞6 d 后開始明顯下降。Cytopore 微載體培養的細胞的MTT 值明顯大于Cytodex 培養細胞的值。

2.4.2 分泌白蛋白量 見圖6。

圖6 微載體培養的大鼠肝細胞分泌白蛋白比較(±s，g/L)Fig.6 Albumin concentration of rat hepatocytes growth in microcarrier

由圖6 可知，Cytopore、Cytodex 微載體培養的大鼠肝細胞所測的白蛋白分泌量在前6 d 均呈上升趨勢，第6 d 時其細胞分泌量最大，Cytopore 最大達到0.95 g/L，Cytodex 最大達到0.86 g/L，并從第6 d 后開始緩慢下降。Cytopore 微載體培養的細胞的白蛋白分泌量普遍大于Cytodex 培養細胞的值。

2.4.3 尿素合成量 見圖7。

由圖7 可知，Cytopore、Cytodex 微載體培養的大鼠肝細胞的尿素合成量在前6 d 均呈上升趨勢，并在第6 d時其細胞尿素合成量最大，Cytopore 最大達到6.1 mmol/L，Cytodex 最大達到2.79 mmol/L，并從第6 d 后開始逐漸下降。總體來說，Cytopore 微載體培養的細胞尿素的合成量明顯大于Cytodex 培養細胞的值，是Cytodex 的1 ～2 倍。

圖7 微載體培養的大鼠肝細胞尿素合成量比較±s，mmol/L)Fig.7 Synthesized urea of rat hepatocytes growth in microcarrier

2.4.4 葡萄糖消耗量 見圖8。

圖8 微載體培養的大鼠肝細胞葡萄糖含量比較珋±s，μmol/mL)Fig.8 Synthesized urea of rat hepatocytes growth in microcarrier

由圖8 可知，Cytopore、Cytodex 微載體培養的大鼠肝細胞所消耗的葡萄糖量在前6 d 均呈上升趨勢，并在第6 d 時其細胞葡萄糖含量最大，Cytopore最 大 達 24. 73 μmol/mL，Cytodex 最 大 達17.89 μmol/mL，并從第6 d 后開始緩慢下降。Cytopore 培養的細胞消耗的葡萄糖量在培養期間明顯大于Cytodex 培養細胞的值，是Cytodex 的1 倍。

目前很多實驗證實，在細胞增殖生長和代謝功能上，微載體培養明顯優于靜止培養，是大規模擴增培養細胞很有前景的技術手段［15-16］。

3 結論

以微載體Cytopore 培養大鼠肝細胞的MTT 值、代謝指標值是Cytodex 的1 ～1.5 倍，在細胞培養期間，以Cytopore 為載體培養的細胞生長密度比Cytodex 高，細胞生長時間多4 d 左右。原因可能是Cytodex 是由葡聚糖構成的實心球體微載體，比表面積為2 700 cm2/g，細胞鋪滿表面后，就無法繼續粘附生長，阻礙細胞在培養期間代謝;而Cytopore 為疏松的空心多孔網狀結構，比表面積為1.1 m2/g，其比表面積是Cytodex 的4 倍，大多數細胞可以在孔內立體生長，為細胞的增殖提供了足夠的空間，良好的孔隙有利于細胞的代謝，更適合大鼠肝細胞BRL 的培養。但由于它的多孔結構，在顯微鏡下不易觀察到孔洞內細胞生長情況，只能在掃描電鏡下對細胞進行染色處理后才可觀察，無法實時在線觀察。

［1］ Khalil M，Shariat-Panahi A，Tootle R，et al.Human hepatocyte cell lines proliferating as cohesive spheroid colonies in alginate markedly upregulate both synthetic and detoxificatory liver function［J］. J Hepatol，2001，34 (1):68-77.

［2］ Vecht-Lifshitz S E，Magdassi S，Braun S. Pellet formation and cellular aggregation in Streptomyces tendae［J］. Biotechnology and Bioengineering，1990，35:890-896.

［3］ Kemeny S F，Cicalese S，Figueroa D S，et al.Glycated collagen and glucose increase endothelial cell adhesion strength［J］. Journal of Cellular Physiology，2013，228(8):1727-1736.

［4］ Remya K，Joseph J，Mani S，et al.Nanohydroxyapatite incorporated electrospun polycaprolactone/polycaprolactone polyethyleneglycol polycaprolactone blend scaffold for bone tissue engineering applications［J］. Journal of Biomedical Nanotechnology，2013，9(9):1483-1494.

［5］ GE-Healthcare. Cytodex surface microcarriers［R］. Sweden:Wikstroms，2002.

［6］ 張瑞，韓寶三，吳薇，等. 微載體及其在肝細胞培養中的作用與應用［J］. 中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(32):6331-6334.

［7］ Tao X，Shaolin L，Yaoting Y. Preparation and culture of hepatocyte on gelatin microcarriers［J］. J Biomed Mater Res A，2003，65(2):306-310.

［8］ Kiyota A，Matsushita T，Ueoka R.Induction and high density culture of human hepatoblasts from fetal hepmocytes with suppressing transformation［J］. Biol Pharm Bull，2007，30(12):2308-2311.

［9］ 胡顯文，肖成祖，高麗華，等. 用多孔微載體大規模長期培養動物細胞的方法［J］. 生物技術通報，2001，1(1):45-48.

［10］ Heath C，Kiss R. Cell culture process development:advances in process engineering［J］.Bioteehnol Prog，2007，23:46-51.

［11］Kistner O，Barrett P N，Mundt W，et al.Development of a mammalian cell(Veto)derived candidate influenza virus vaccine［J］.Vaccine，1998，16:960-968.

［12］ Trabelsi K，Majoul S，Rourou S，et al. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodexl microcarriers and in a stirred bioreactor［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93:1031-1040.

［13］ Chevalot I，Visvikis A，Nabet P，et al. Production of amembrane-bound protein，the human gammaglutamyl transferase，by CHO cells cultivated on microcarriers，in aggregates and suspension［J］. Cytotechnology，1994，16:121-129.

［14］Nikolai T J，Hu W S. Cultivation of mammalian cells on macroporous microcarriers［J］. Enyzme and Microbial Technology，1992，14:203-208.

［15］Michele L，Marquette，Diane Byerly，et al.A novel in vitro three dimensional skeletal muscle model［J］. Biol Animal，2007，43:255-263.

［16］Faeer S R，Zaharias R S，Andracki M E，et al.Rotary culture enhances pre-osteoblast aggregation and mineralization［J］.J Dent Res，2005，84(6):542-547.