RP-HPLC 測定山竹花不同部位蘆丁、木犀草素的含量

梁春輝，張寒，任連新

(1.西安市兒童醫院，陜西 西安 710083;2.西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021;3.華北制藥股份有限公司，河北 石家莊 051430)

山竹花(Disporam cantoniense (Lour.)Merr.)別名萬壽竹、豪豬七、白毛七、竹葉參等，產于秦嶺北坡甘肅天水的小隴山、陜西太白山及南坡之略陽、佛坪、寧陜和甘肅、成諸縣等。山竹花生長海拔高度700 ～3 000 m，多見山坡灌叢中或林下草地，喜肥沃而濕潤的腐殖土。其以根及根莖入藥，性寒味甘，具有清熱解毒、舒筋活血之功效，民間常將其用于治療痛經、跌打損傷、風濕關節痛、骨折等癥［1-2］。

目前，國內相關文獻報道山竹花中含有蘆丁、木犀草素、芹菜素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷等黃酮類成分［3］。目前國內外尚未見山竹花中黃酮類含量測定的相關記載，本文在參考了大量有關山竹花和黃酮類化合物提取分離及含量測定的文獻資料后，分別以蘆丁和木犀草素為對照品對山竹花進行了不同部位(葉、莖、根)中蘆丁和木犀草素的含量測定。另外，由于山竹花中含有木犀草素-7-Oβ-D-葡萄吡喃糖苷等苷類成分，而苷類在酸性條件下易發生水解，本文在實驗過程中將用于測定木犀草素的樣品溶液進行酸處理，再次測定該樣品中木犀草素的含量，并與未經酸處理的樣品測得的結果進行了比較。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

蘆丁對照品(HPLC 檢測用，純度≥98%);木犀草素對照品(HPLC 檢測用，純度≥98%);甲醇，色譜純;其它試劑均為分析純;山竹花采自秦嶺太白山，經西安醫學院生藥教研室汪興軍老師鑒定為百合科山竹花。

Agilent 1260 高效液相色譜儀;Thermo C18柱色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);KQ-300B 型超聲波清洗器;GR-202 型分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件與系統適用性

1.2.1.1 蘆丁 色譜柱:Thermo C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，流動相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(38∶62);流速1.0 mL/min;檢測波長358 nm。在此色譜條件下，蘆丁分離度較好［4-8］，見圖1。

圖1 蘆丁對照液色譜圖Fig.1 Rutin control the liquid chromatogram

1.2. 1. 2 木犀 草素 色 譜柱:Thermo C18柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃;進樣量20 μL;流動相:甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)，流速1.0 mL/min，檢測波長350 nm。在此色譜條件下，木犀草素分離度較好［9-10］，見圖2。

圖2 木犀草素對照液色譜圖Fig.2 Luteolin control liquid chromatogram

1.2.2 對照品溶液的配制

1.2.2.1 蘆丁對照品溶液的配制 精密稱定蘆丁對照品3.9 mg，以60%乙醇并轉移至10 mL 容量瓶中，定容，即得每1 mL 含蘆丁0. 39 mg 的對照品溶液。

1.2.2.2 木犀草素對照品溶液的配制 精密稱定木犀草素對照品3.4 mg，以100%甲醇溶解并轉移至10 mL 容量瓶中，定容，即得每1 mL 含木犀草素0.34 mg 的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的配制

1.2.3.1 蘆丁供試品溶液的配制 分別精密稱取山竹花根、莖、葉粉末5 g(各3 份，編號a、b、c、d、e、f)，置于500 mL 圓底燒瓶中，加入200 mL 蒸餾水，沸水煎煮1 h，過濾，所余藥渣加100 mL 蒸餾水繼續煎煮45 min，合并兩次煎液，用四層紗布過濾，抽濾，將所得濾液水浴蒸干，以60%乙醇溶解，并轉移至50 mL 容量瓶，定容即得蘆丁供試品溶液。

1.2.3.2 木犀草素供試品溶液(Ⅰ)的配制 分別精密稱取山竹花根、莖、葉粉末5 g(各3 份，編號a、b、c、d、e、f)，將其置于500 mL 索氏提取器中，向內加入200 mL 石油醚，浸泡12 h 后，70 ℃水浴加熱提取至無色，放置至室溫，旋轉蒸干石油醚，加甲醇100 mL，超聲提取30 min，將甲醇水浴蒸干，以100%甲醇溶解，并轉移至10 mL 容量瓶中，定容即得木犀草素供試品溶液(Ⅰ)。

1.2.3.3 木犀草素供試品溶液(Ⅱ)的配制 分別精密量取木犀草素供試品溶液(Ⅰ)中9 份溶液200 μL，向其中各加入1 滴稀硫酸溶液，搖勻后靜置10 min，即得木犀草素供試品溶液(Ⅱ)。

1.2.4 測定方法 分別精密吸取1.2.2、1.2.3 節配制所得的對照品溶液、供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按1.2.1 節色譜條件測定。

2 結果與討論

2.1 專屬性實驗

2.1.1 蘆丁 分別吸取蘆丁對照品溶液、供試品溶液各20 μL 注入高效液相色譜儀，按照1.2.1.1 節色譜條件測定，結果在供試品中蘆丁與對照品色譜峰保留時間一致，并且能達到基線分離，見圖3。

圖3 山竹花樣品色譜圖Fig.3 Sample chromatogram

2.1.2 木犀草素 分別吸取木犀草素對照品溶液、供試品溶液(Ⅰ)(Ⅱ)20 μL，注入高效液相色譜儀，按照1.2.1.2 節色譜條件進行測定，結果在供試品中木犀草素與對照品色譜峰保留時間一致，并且能達到基線分離，見圖4。

圖4 山竹花樣品色譜圖Fig.4 Sample chromatogram

2.2 線性關系的考察

2.2.1 蘆丁 精密量取1.2.2 節蘆丁對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL 至5 mL 容量瓶中，加入60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。按上述色譜條件，分別進樣20 μL，測定。以對照品進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)分別繪制標準曲線，得蘆丁線性回歸方程為Y =16 232X +47.054，r=0.999 7(n=5)。結果表明，蘆丁進樣量在0.007 8 ～0.124 8 mg/mL 范圍內線性關系良好。2.2.2 木犀草素 精密量取1.2.2 節木犀草素對照品溶液0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 至5 mL 容量瓶中，用100%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。按上述色譜條件，分別進樣20 μL，測定。以對照品進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)分別繪制標準曲線，得木犀草素回歸方程為Y =12 040X+11.358，r=0.999 1(n =5)。結果表明，木犀草素進樣量在0.003 4 ～0.054 4 mg/mL 范圍之內線性關系良好。

2.3 重復性實驗

精密量取1.2.2 節蘆丁、木犀草素對照品溶液各6 份(20 μL)，分別進樣，測定峰面積。結果蘆丁RSD 為0.003 5%，木犀草素RSD 為0.034 9%，表明二者重復性良好。

2.4 穩定性實驗

精密量取蘆丁、木犀草素對照品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h 各進樣20 μL，分別測定兩者的峰面積。結果蘆丁RSD 為0.002 5%，木犀草素RSD為1.48%，表明二者均在24 h 內穩定。

2.5 加樣回收率實驗

取已知含量的山竹花葉b、e 供試品溶液各3份，精密量取b 溶液1 mL，加入蘆丁對照品溶液100 μL;量取e 溶液400 μL，加入木犀草素對照品溶液100 μL，分別混勻即得供試樣品。分別量取以上兩種溶液各20 μL 進行測定，計算各自加樣回收率。結果蘆丁加樣平均回收率為97.51%，RSD 為0.13%;木犀草素加樣平均回收率為96.03%，RSD為0.54%。表明該樣品制備方法準確性較高，可靠性較強。

2.6 樣品測定

精密量取1. 2. 3 節制得的供試品溶液，進樣20 μL，計算各成分含量，測定結果見表1。

表1 樣品測定結果Table 1 Disporam cantoniense(Lour.)Merr.samples for the determination of results

由表1 可知，山竹花葉中蘆丁含量最高，木犀草素葉中含量比莖中高，根中木犀草素未檢出，經酸處理過的樣品溶液中木犀草素比沒有處理過的含量高。

3 結論

(1)在參考文獻［4-8］中，蘆丁的檢測波長為368，358，510 nm，實驗中發現在358 nm 處蘆丁的峰型和峰面積均十分理想，故本實驗采用358 nm 對蘆丁進行檢測。

(2)在參考文獻［9-10］中木犀草素的檢測波長為283，350 nm，實驗中發現在350 nm 處木犀草素的峰型和峰面積均十分理想。故本實驗采用350 nm對木犀草素進行檢測。

(3)本實驗采用反相高效液相色譜法，分別建立測定山竹花藥材中蘆丁、木犀草素的含量的方法，所用方法靈敏、簡單易行，專屬性、重復性、回收率均符合要求。

(4)對比木犀草素樣品溶液(Ⅰ)、(Ⅱ)的結果可以看出，經酸處理過的樣品溶液中木犀草素含量更高，說明山竹花中的黃酮苷類成分在酸性條件下發生了水解，從而測得樣品中木犀草素的含量升高。

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