白及多糖提取工藝優化

趙寧，李偉澤，張倩，張存勞

白及為蘭科植物白及［Bletillastriata (Thunb.)Reichb. f.］的干燥塊莖，又名良姜、紫蘭。據《本草綱目》記載:“白及別名連及草，甘根，白給。其根白色，連及而生，故曰白及”，其味苦、甘、澀，性平微寒，歸肺、胃、肝經。具有補肺、止血、消腫、生肌、斂瘡等功效。主治肺傷咳血、衄血、金瘡出血、癰疽腫毒、潰瘍疼痛等癥。素有“外科最善”之稱，是我國傳統止血藥，現代藥理學研究認為，其主要有效物質為所含的多糖類成分［1］。

白及多糖(BSP)是從中藥白及中提取的一種水溶性高分子黏性多糖，由D-葡萄糖和D-甘露糖按照約1∶4 的比例組成，且以β 型糖苷鍵聚合形成空間螺旋結構;其平均分子量在65 000 ～150 000 kDa，溶于水可形成粘稠的凝膠液，從而具有良好的生物粘附性［2］，可作為多種劑型的載體材料，具有黏膜黏附、黏合［3］、緩釋［4］、乳化［5］、包囊［6］等多種功能，且兼具抗潰瘍、抗炎、止血等廣泛的藥理活性，安全無毒，因而廣泛應用于藥用輔料、生物醫學材料與化妝品等領域。本文考察白及多糖的最佳提取工藝，為白及多糖作為一種優良的藥物載體的發展奠定一定的基礎。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

白及;D-無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院110833-201205);糧食酒精，食品級;水為純化水;苯酚、濃硫酸均為分析純。

QUINTIX224-1CN 電子天平;UV-1780 紫外-可見分光光度計;SHZ-DⅢ循環水式真空泵;HH-S4 電熱恒溫水浴箱;RE-2000A 旋轉蒸發儀。

1.2 實驗方法

白及20 g 加入200 mL 水，浸泡1 h。加熱至80 ℃，提取45 min。重復1 次，合并提取液濃縮至濃度1 g 原藥材/mL。冷至室溫。加入濃度70%的乙醇進行沉淀，靜置24 h。過濾，得BS10 粗提物，用苯酸-硫酸法測定含量。

1.3 白及多糖含量測定

1.3.1 標準溶液的配制 精密稱取D-無水葡萄糖對照品0.100 9 g，加純化水溶解，定容至100 mL。現用現配。

1.3. 2 5% 苯酚溶液的配制 精密稱取苯酚5.001 2 g，加純化水稀釋，待完全溶解，定容至100 mL(棕色瓶保存)，放置冰箱內儲存備用。

1.3.3 標準曲線的制備 精密量取1.3.1 節標準品溶液0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL 于10 mL 容量瓶中，分別加入1 mL 5%苯酚溶液，5 mL 濃硫酸振搖，靜置30 min。加純化水定容至10 mL，冷卻。在490 nm 波長下測定吸光度，并繪制標準曲線。以葡萄糖的量(X，mg/mL)為橫坐標，吸光度(Y)為縱坐標，得回歸方程Y =0. 042 9X +0. 092 2(R2=0.999 0)，表明葡萄糖質量濃度在6 ～16 mg/L 吸光度呈良好的線性關系。

1.3.4 樣品分析 精密稱取0.1 g 白及粗多糖，加純化水溶解，定容于100 mL 容量瓶中，移液管吸取1 mL 于10 mL 容量瓶中稀釋10 倍。再吸取1 mL于10 mL 容量瓶中，加入1 mL 5%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，振搖，靜置30 min。加純化水定容，冷卻。在490 nm 處測吸光度，計算粗多糖含量。

1.3.5 精密度實驗 分別精密量取0.5 mL 葡萄糖標準溶液于5 支10 mL 容量瓶中，加1 mL 5%苯酚溶液，5 mL 濃硫酸，振搖，靜置30 min。定容，冷卻。在490 nm 處測定吸光度，計算得RSD 為2.388%(n=5)。

1.3.6 加樣回收率實驗 精密量取白及多糖樣品稀釋液0.5 mL 于9 支10 mL 容量瓶中，分別按照高、中、低劑量加入一定量的葡萄糖標準品溶液，純化水定容，測定吸光度，得平均加樣回收率為100.79%，RSD=0.765%(n=9)。

2 結果與討論

2.1 加水量對白及多糖提取率的影響

稱取5 份白及藥材20 g，分別加入6，8，10，12，14 倍量水，浸泡30 min，在80 ℃提取45 min。提取2 次。合并提取液，濃縮，使每毫升濃縮液相當于含原藥材1 g，放至室溫，調整酒精濃度至70%，靜置24 h，過濾。取濾餅，置于冰箱中冷凍保存，得多糖粗提取物，照苯酚-硫酸法測含量，結果見圖1。

由圖1 可知，隨著加水量的增加，多糖提取率逐漸增高，當加水量達到10 倍以上，多糖提取的升高逐漸趨于緩和，而加水量的持續增多會為后續濃縮、醇沉等工藝帶來困難，綜合考慮，以10 倍量水為最佳。

圖1 加水量對白及多糖提取率的影響Fig.1 The influence of the added water amount on the polysaccharide content

2.2 浸泡時間對白及多糖提取率的影響

稱取5 份白及藥材20 g，各加入10 倍量水，分別浸泡30，50，70，90，110 min，其他操作同“2. 1”節，結果見圖2。

圖2 浸泡時間對白及多糖提取率的影響Fig.2 The influence of the soaking time on polysaccharide content

由圖2 可知，隨著時間的增長，多糖提取率顯著增加;而90 min 后多糖提取率增加趨于緩慢。

2.3 水浴溫度對白及多糖提取率的影響

稱取5 份白及藥材20 g，各加入10 倍量水，浸泡90 min，分別在60，70，80，90，100 ℃提取45 min，提取2 次。其他操作同“2.1”節，結果見圖3。

圖3 溫度對白及多糖提取率的影響Fig.3 The influence of the temperature on the polysaccharide content

由圖3 可知，多糖提取率隨溫度升高明顯增加，90 ℃時達最高，而當溫度達到100 ℃時，提取率下降，原因可能由于多糖的降解，糊化及雜質的增多所引起。

2.4 提取時間對白及多糖提取率的影響

稱取5 份白及藥材20 g，各加10 倍量水，浸泡90 min，90 ℃提取30，50，70，90，110 min，其他操作同“2.1”節，結果見圖4。

圖4 提取時間對白及多糖提取率的影響Fig.4 The influence of the decoction time on the polysaccharide content

由圖4 可知，提取率隨時間延長而增加，90 min后提取率逐漸下降。藥材的提取是溶質從藥材中逐漸溶出的過程，因此在一定范圍內增加提取時間，有利于有效成分的提出，但提取時間過長，雜質成分的溶出亦將增多，反而使提取率降低。

2.5 提取次數對白及多糖提取率的影響

稱取4 份白及藥材20 g，各加10 倍量水，浸泡90 min，90 ℃提取90 min，分別提取1，2，3，4 次。其余操作同“2.1”節，結果見圖5。

圖5 提取次數對白及多糖提取率的影響Fig.5 The influence of the number of decoction on the polysaccharide content

由圖5 可知，＞2 次后，多糖提取率趨于緩和。綜合考慮提取效率、節約能源、后續操作及生產周期等因素，確定2 次為最佳提取次數。

2.6 醇沉濃度對白及多糖提取率的影響

稱取5 份白及藥材20 g，加10 倍量水，浸泡90 min，90 ℃加熱90 min，提取2 次。合并提取液，濃縮，使每毫升濃縮液相當于含原藥材1 g，放至室溫，分別調整醇濃度至65%，70%，75%，80%，85%，其余操作同“2.1”節，結果見圖6。

圖6 醇沉濃度對白及多糖提取率的影響Fig.6 The influence of the alcohol concentration on the polysaccharide content

由圖6 可知，醇沉濃度增大時提取率增加，75%以后趨于緩和。

2.7 正交實驗法優化提取工藝

2.7.1 正交實驗結果 在單因素實驗的基礎上，選擇對多糖提取率影響較大的浸泡時間、提取溫度、提取時間、醇沉濃度4 個因素進行，正交實驗因素水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 L9(34)正交實驗結果Table 2 Design and results of L9(34)orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

由表2 可知，各因素對白及多糖提取率的影響大小依次為B ＞C ＞A ＞D，最佳工藝條件為A3B3C3D2。由表3 可知，提取溫度(B)具有顯著性影響，A、C 因素對白及多糖提取率無顯著性影響。結合實際操作、生產周期及單因素實驗結果考慮，選擇最佳工藝為A2B3C2D2，即白及多糖的最佳提取條件為:稱取藥材，加10 倍量水，浸泡90 min，90 ℃提取90 min，提取2 次。合并提取液，濃縮至每毫升相當于含原藥材1 g，調整醇濃度至75%，靜置24 h，過濾。

2.7.2 驗證實驗 稱取白及藥材3 批，按最佳工藝A2B3C2D2進行提取，結果見表4。

表4 多糖提取工藝驗證Table 4 Results of verification experiment

由表4 可知，3 批次藥材中白及多糖提取率較高且穩定，RSD 3.57%，平均提取率7.64%。

3 結論

提取白及多糖的最佳工藝條件為:加10 倍量水，浸泡90 min，90 ℃提取90 min，提取2 次。合并提取液，濃縮至每毫升含原藥材1 g，調整醇濃度至75%，靜置24 h，過濾，即得。在此條件下，白及多糖提取率可達7.64%。

［1］ 孫達峰，史勁松，張衛明，等.白芨多糖膠研究進展［J］.食品科學，2009，30(3):296-298.

［2］ 程安媛.新型胃粘附材料——白芨多糖的制備及膜粘附性體內外評價［D］.重慶:重慶醫科大學，2009.

［3］ 徐花榮.白芨多糖的提取分離及其在中藥水凝膠巴布劑型中的應用［D］.西安:西北大學，2006.

［4］ 李玉先. 阿莫西林白芨膠生物粘附緩釋膠囊的研制［D］.重慶:重慶醫科大學，2005.

［5］ 張潔，史勁松，孫達峰，等.白芨多糖膠-瓜爾膠復配溶液的流變性［J］.中國野生植物資源，2010，29(1):55-61.

［6］ 王如平，吳婷，張衛明，等. 丹皮酚及其白芨多糖包合物對葡萄保鮮作用的比較研究［J］. 食品科學，2008，29(11):645-648.